L’obiettivo del presente protocollo è quello di dimostrare l’iniezione intra-prostatica delle cellule di carcinoma della prostata, con conseguente castrazione. Orthotopic modelli pre-clinici di carcinoma della prostata androgeno-dipendente e castrazione-resistente sono fondamentali per studiare la malattia nel contesto di un microambiente tumorale clinicamente rilevanti e un ospite immunocompetente.
Modellazione di orthotopic del tumore è uno strumento prezioso per la ricerca pre-clinica del carcinoma della prostata, come ha più vantaggi rispetto entrambi sottocutaneo e transgenici modelli murini geneticamente. A differenza dei tumori sottocutanei, orthotopic tumori contengono sistema vascolare clinicamente più accurata, microambiente tumorale e risposte alle terapie multiple. In contrasto ai modelli murini geneticamente ingegnerizzati, orthotopic modelli possono essere eseguite con costi inferiori e in meno tempo, implicano l’uso di mouse altamente complesso ed eterogeneo o linee cellulari tumorali umane, piuttosto che singole alterazioni genetiche e queste cellule linee può essere geneticamente modificato, tale da esprimere agenti imaging. Qui, presentiamo un protocollo per iniettare chirurgicamente una linea cellulare di carcinoma della prostata murino luciferasi – e mCherry-esprimendo il lobo anteriore della prostata dei topi. Questi topi hanno sviluppato i tumori di orthotopic che sono stati monitorati in modo non invasivo in vivo e ulteriormente analizzati per volume del tumore, il peso, sopravvivenza del mouse e infiltrazione immune. Inoltre, topi del tumore-cuscinetto ortotopico sono stati castrati chirurgicamente, che conduce alla regressione del tumore immediato e ricorrenza successiva, che rappresenta il cancro della prostata resistente alla castrazione. Anche se per eseguire questa procedura è necessaria abilità tecnica, questo modello syngeneic ortotopico di cancro alla prostata resistente alla castrazione sia androgeno-dipendente è di grande utilità per tutti i ricercatori nel campo.
Carcinoma della prostata è stimato a hanno la più alta incidenza (161.360 uomini) e causare la morte di cancro maschile terzo-più (84.590 uomini) nel 20171. Dopo una diagnosi, i tumori della prostata sono androgeno-dipendente e sono trattati da prostatectomia chirurgica, la radioterapia e/o terapia di deprivazione androgenica (ADT), eppure ogni trattamento è associato con le morbosità e le complicazioni principali più2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. nonostante la regressione del tumore dopo ADT, quasi tutti i tumori si ripetono come il cancro della prostata resistente alla castrazione (CRPC). In questa fase, terapie approvate includono docetaxel, immunoterapia di Sipuleucel-T e le piccole molecole anti-androgeni enzalutamide e abiraterone, ancora nessuna terapia individuale conferisce un beneficio di sopravvivenza di più di 5,2 mesi11, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. Pertanto, gli uomini in tutte le fasi di carcinoma della prostata hanno bisogno gestione di morbidità, per quale malattia pre-clinico ottima modellazione è cruciale e opzioni di trattamento migliore.
Con procedura corretta, linee cellulari di carcinoma della prostata possono essere chirurgicamente instillati nella prostata murina, portando allo sviluppo di entrambi i tumori syngeneic o xenogeniche ortotopico. Modellazione di orthotopic del tumore è ideale per tutti i tumore biologia e droga sviluppo ricerca, permettendo per lo sviluppo del tumore con un microambiente tumorale clinicamente rappresentative (TME). Studi precedenti hanno dimostrato che i tumori sottocutanei (s.c.) hanno un sistema vascolare alterata del tumore, che conduce al differenziale e meno risposte clinicamente accurate a terapie anti-angiogeniche18,19. Inoltre, gli studi multipli hanno osservato l’efficacia aumentata o diminuita di più chemioterapici nel trattamento della stessa linea cellulare, a seconda se fosse somministrato s.c. o orthotopically, l’ultimo dei quali rappresentato al meglio ciò che si vede nell’uomo cancro20,21,22. Inoltre, solo in un modello ortotopico di cancro del colon, ma non nel modello s.c., ha fatto i tumori producono il corretti enzimi degradativi necessari per indurre metastasi23. Infine, come immunoterapie continuano ad emergere all’avanguardia nella terapia del cancro, e soprattutto come essi devono ancora fornire benefici significativi per carcinoma della prostata24,25, syngeneic modelli pre-clinici con TME accurata e linfonodi drenanti in ospiti immunocompetent sono critici.
Ci sono molti fattori responsabili per questi risultati contradditori basati su sito del tumore. Con una diversa TME, le cellule tumorali sono esposti a diverso tessuto-specifici dell’endotelio e alterata angiogenesi, interessando così tumore sviluppo26,27. Orthotopic tumori con la TME corretto consentono per consegna farmaco clinicamente rilevanti, condizioni di ipossia e la valutazione di terapie anti-angiogeniche28. Mentre modelli geneticamente (gemme) contengono un’accurata TME, richiedono lunghi tempi per allevamento, costo elevato e sono spesso basato sulle manipolazioni dei geni singoli o pochi eliminato o iperespresso oltre i livelli clinicamente rilevanti. Al contrario, le linee cellulari di carcinoma della prostata umana o murina utilizzate nei tumori di orthotopic, come tumori umani, sono geneticamente molto più complesse, sia all’interno delle singole cellule e nella visualizzazione delle eterogeneità tra cellule29,30. Inoltre a differenza di gemme, linee cellulari di orthotopic del cancro possono essere ingegnerizzate ad per esprimere modalità di imaging o aumentati o diminuzione dei livelli di altre molecole di interesse e in vitro e in vivo risultati sperimentali possono essere confrontati direttamente. Orthotopic tumori possono anche essere formati da cellule primarie derivate dal paziente. Qui, segnaliamo la metodologia per l’esecuzione di iniezioni intra-prostatica delle cellule di carcinoma della prostata che formano i tumori androgeno-dipendente di orthotopic e, dopo la castrazione, ricorrono come orthotopic del CRPC.
In questo manoscritto, delineiamo il protocollo per eseguire iniezioni di cellule di cancro chirurgica intra-prostatico. Abbiamo utilizzato l’androgeno-dipendente e MYC –overexpressing (MYC sovraespressione è visto fino a 80-90% di carcinoma della prostata umane39) linea di cellulare murina del carcinoma della prostata, Myc-CaP, originariamente isolata dal mouse Hi-Myc32 ,33. Questa linea cellulare stabile era transduced per esprimere sia luciferasi e mCherry, per non invasiva in vivo imaging tumorale bioluminescenti e fluorescenti, rispettivamente. Castrazione chirurgica, ulteriore è stata eseguita anche dopo lo sviluppo del tumore androgeno-dipendente, che conduce a regressione del tumore e la ricorrenza successiva. Pertanto, le forniamo dettagli per modellare CRPC sia di carcinoma della prostata androgeno-dipendente di orthotopic in un ospite immunocompetent.
Le cellule Myc-CaP iniettate nel lobo anteriore della prostata dei topi. La prostata del topo è costituito dai lobi della prostata anteriori, ventrali e dorsolateral e prostata umana è costituito da una zona periferica, zona di transizione e zona centrale all’interno di un singolo lobo40. Mentre studi precedenti hanno paragonato il lobo dorsolateral del mouse per il periferico umano anatomicamente ed istologicamente di zona, il sito della maggior parte dei cancri della prostata41ed il lobo anteriore del mouse alla zona centrale umano42, 43, più recente e completa analisi ha dimostrato che il lobo anteriore e lobo dorsolateral visualizzare pattern di espressione genica strettamente correlati, rispetto il lobo ventrale. 44 inoltre, lo sviluppo del cancro della prostata è stato osservato nel lobo anteriore di gemme40, e, per la procedura intra-prostatico, lobo anteriore permette l’iniezione del volume necessario di soluzione di cellule di cancro con perdita minima e variabilità.
Utilizzando s.c. e transgenici GEM cancro modelli hanno più difetti e limitazioni. S.c. tumori coltivati in un artificiale TME hanno risposte differenziali a chemioterapie, in contrasto con entrambi i tumori orthotopic dalle stesse linee cellulari di malattia umana20,21,22. Questo può essere dovuto il sistema vascolare alterato dei tumori s.c., come esemplificato dalla loro risposta differenziale a terapia anti-angiogenica18,19. Al contrario, i tumori orthotopic sviluppano con un’adeguata TME, linfonodi drenanti e sistema vascolare e possono essere eseguiti con linee murine, consentendo quindi anche per l’analisi dell’immunologia dei tumori e risposta immunoterapie.
Transgenici gemme sviluppano i tumori con un’adeguata TME in un ospite immunocompetent, eppure questi modelli in genere semplificare eccessivamente tumorali umane attraverso lo sviluppo di tumori con singola o poche alterazioni genetiche29. Un’analisi di Myc-CaP e altre linee cellulari di carcinoma della prostata ha rivelato che contenevano molto maggiore somatico copia numeri modifiche e alterazioni cromosomiche che i tumori dai topi Hi-Myc ed altre gemme da cui erano derivate29. Ulteriormente, gemme sono limitati dall’aumento dei costi e tempi necessari per topi allevamento per eseguire esperimenti di potenza sufficiente. Modellazione di orthotopic del tumore può superare questi limiti. Linee cellulari di carcinoma della prostata umane e murine contengono molte alterazioni genetiche pertinenti alla malattia umana29e, come il cancro umano, mostrano anche la grande eterogeneità tra le singole celle30. Orthotopic murino syngeneic tumori per analisi immunologiche, mentre orthotopic tumori umani xenogenici consentono per le analisi di terapeutica sulle cellule umane. Infine, a differenza con gemme, cella linee possono essere modificati prima di iniezione, che permette per l’espressione di bioluminescenti o imaging molecole fluorescenti per monitorare la crescita del tumore, normalizza il carico del tumore fra gruppi sperimentali, monitorare la risposta al trattamento e alla seguire la regressione del tumore e la ricorrenza di CRPC dopo castrazione chirurgica.
Punti critici in questo protocollo sono individuazione e trasportarli vescichetta seminale e annesso lobo anteriore della prostata senza danneggiare altri tessuti o perforare la vescichetta seminale, eseguendo un’iniezione intra-prostatico successo il 30 µ l di cella sospensione senza perdite e raccogliendo correttamente eventuali perdite per prevenire lo sviluppo di tumore non-orthotopic in tutto l’addome. La limitazione principale di iniezioni intra-prostatico è raggiungere l’abilità tecnica necessaria per ridurre al minimo la variabilità di tumore tra i topi. Ciò è particolarmente importante per la modellazione CRPC, che ha aggiunto la variabile della castrazione chirurgica. Topi intra-prostatically iniettati e castrati devono anche essere seguiti attentamente per il recupero e gli eventi avversi, come hanno subito due interventi chirurgici principali sopravvivenza. Un’altra limitazione è la volta di ogni iniezione intra-prostatico. Questo può essere ridotto al minimo di 20 min, e il chirurgo assistente può preparare il prossima mouse come il mouse corrente è essere suturato. Infine, i tumori orthotopic Myc-CaP sono aggressivi, massa velocemente crescente tumori che raggiungono l’endpoint di sopravvivenza in circa 46 giorni (e più presto 35 giorni) dovuto il tumore primario. Gli studi che richiedono trattamenti a lungo termine o rallentare lo sviluppo del tumore dovrebbero essere ottimizzati empiricamente per il regime di conteggio e trattamento delle cellule di iniezione iniziale. In contrasto con le limitazioni dei tumori s.c. e gemme, tutte le limitazioni di cui sopra del modello ortotopico del tumore possono essere superate, e ulteriori modifiche del protocollo possono essere fatta base sulle esigenze individuali, sperimentale.
Come il trapianto orthotopic del modello del tumore prevede l’utilizzo di in vitro-gestite, queste cellule possono essere modificate a seconda delle esigenze dello studio. Qui, abbiamo modificato queste cellule per esprimere stabilmente la luciferasi e mCherry per il monitoraggio di tumore in vivo . Abbiamo anche eseguito un ko CRISPR-Cas9 del soppressore del tumore PTEN, per generare una linea cellulare più aggressivo, clinicamente rilevanti che cresce più velocemente come tumori orthotopic (manoscritto nella recensione). Con i vantaggi del modello ortotopico del tumore, la capacità di studiare sia carcinoma della prostata androgeno-dipendente e CRPC ed il potenziale per esprimere modalità di imaging o atterramento o iperesprimere geni select, questo protocollo serve come una risorsa preziosa per tutti ricerca sul cancro della prostata.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzioni salute Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898), Antonio Ugo (NCI R01 CA167966, NCI R01 CA123484, NCI P50 CA180995) e Jonathan Anker (NCI F30 CA203472).
Myc-CaP cell line | ATCC | CRL-3255 | Verify as mycoplasma-free before use |
Micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5910 | |
Graege forceps | Roboz | RS-5135 | |
Graefe tissue forceps | Roboz | RS-5150 | |
Olsen-Hegar needle holder with suture cutters | FST | 12002-12 | |
50 µL Syringe 705 RN SYR | Hamilton | 7637-01 | Sterilize by ethylene oxide gas |
28-gauge Needles Small Hub RN | Hamilton | 7803-02 | Point style 4, Angle 45°, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas |
RPMI | Gibco | 18875-093 | |
FBS | Gibco | 10437-028 | |
Pencillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free | Corning | 356237 | Thaw on ice in 4°C overnight before use |
Isoflurane | Henry Schein | 11695-0500-2 | Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM) |
26 5/8-gauge syringe | BD | 309597 | For meloxicam and buprenorphine injections |
Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL | 12496-0757-5 | Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM | |
Ophthalmic ointment lubrication | Akron | 17478-162-35 | |
Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%) | Purdue Products | 67618-151-16 | |
Sterile non-adhering pads | Moore Medical | 10775 | |
Sterile alcohol wipes | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
Surgical microscope Stemi DV4 | Zeiss | ||
Sterile polyester tipped applicators | Puritan | 25-806 1PD | |
5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | J493G | |
4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | 699H | |
Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Sterile saline 0.9% sodium chloride | Hospira | 0409-4888-02 | |
Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL | Henry Schein | 11695-6925-1 | Acquired from Northwestern University CCM |
D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate | Goldbio | LUCNA | |
IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer | ||
Cauery surgical pen | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
CD3ε antibody (clone 2GV6) | Ventana | 790-4341 | |
Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 | |
Androgen receptor antibody | Thermo Scientific | RB-9030-P1 | 1:500 staining dilution |
Synaptophysin antibody (clone Z66) | Life Technologies | 18-0130 | 1:200 staining dilution |