Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa fenotipicamente e Leishmania diversificada e adaptável presente no solo, água e ambientes mais humanos, bem como a microflora da pele. Comparado a muitas espécies bacterianas, p. aeruginosa tem um genoma relativamente grande de 5.5-7 Mbp com conteúdo de alto G + C (% de 65-67). Além disso, uma parte significativa dos seus genes estão envolvida na adaptabilidade metabólica e fazem parte de redes de regulação, permitindo uma grande flexibilidade em resposta ao estresse ambiental¹. P. aeruginosa expressa uma infinidade de fatores de virulência, apresenta tendência para a forma de biofilmes, possui a habilidade de coordenar as respostas através do quórum de múltiplos caminhos de detecção e exibe uma notável capacidade de desenvolver resistência aos antibióticos e tolerância de^{2,3,4,5,6,7,8}. Esses atributos apresentam desafios significativos no tratamento de infecções causadas por p. aeruginosa.

Crônica infecções de p. aeruginosa podem ocorrer em vários Estados da doença. Fibrose cística (CF), uma doença genética causada pela mutação do gene da Fibrose cística regulador de condutância transmembrana (CFTR) , resulta em secreções infectadas, inspissated dentro das vias aéreas, bronquiectasias progressiva e, finalmente, morte de insuficiência respiratória⁹. Pela idade adulta, a maioria dos pacientes com FC é cronicamente infectada com p. aeruginosa, que desempenha um papel fundamental na morbilidade e mortalidade associadas a esta doença¹⁰. Além disso, pacientes com lesões de queimadura grave¹¹, traqueostomia¹², as artroplastias¹³ou permanência de cateteres¹⁴ correm o risco de infecção p. aeruginosa , relacionada com a capacidade das bactérias para formar biofilmes e fuga de acolhimento respostas inflamatórias¹⁵. Além disso, colonização ocorre sem concorrência depois uma população tolerante ou resistente aos antibiótico multi é selecionada através do tratamento antimicrobiano de largo espectro, sequencial^{12,16,17 , 18}. melhor compreensão da patogênese de p. aeruginosa terá implicações significativas para inúmeros Estados de doença.

Vários isolados clínicos de p. aeruginosa , incluindo cepas PAO1, PA103, PA14 e PAK, têm sido muito estudados para investigar diferentes características de p. aeruginosa patogênese. Estirpe PA14 é uma clínica isolada que pertence a um dos grupos clonal mais comum no mundo^19,20 e não tem sido extensivamente passada no laboratório. PA14is altamente virulento em vertebrados modelos de infecção, com uma notável endotoxina perfil²¹, pili estrutura²², patogenicidade dos consoles²³, tipo sistema do secretion de III (TTSS), citotoxicidade para mamíferos células²⁴ e perfis em antibióticos de resistência e persistência²⁵. Além disso, PA14 também é altamente virulento em numerosos sistemas de modelo do patógeno-hospedeiro, incluindo folha de planta infiltração modelos^26,27, infecçãoCaenorhabditis elegans modelos^{28, 29}, inseto modelos^30,31, bem como pneumonia rato modelos^32,33 e³⁴modelos de queimadura da pele.

Bibliotecas de todo o genoma mutantes são coleções de mutantes isogénicas nos genes não essenciais que constituem ferramentas muito poderosas para compreender a biologia de um organismo, permitindo que a análise da função do gene em escala genômica. Dois perto de-saturação transposon inserção mutante bibliotecas construídas em p. aeruginosa estão atualmente disponíveis para distribuição. Os locais de inserção dos transposões foram determinados para ambas as bibliotecas. Essas bibliotecas não redundante chamadas facilitam estudos de todo o genoma de cepas bacterianas, diminuindo consideravelmente o tempo e custo envolvidos na triagem descaracterizada mutantes transposon aleatório. P. aeruginosa PAO1 transposon mutant biblioteca, construída no MPAO1 isolar de estirpe PAO1 usando transposões ISphoA/ ha e élacZ/ ha³⁵, é comissariada pelo laboratório Manoil, Universidade de Washington. A biblioteca consiste em uma coleção de 9.437 mutantes transposon sequência-verificado que oferece cobertura ampla do genoma e inclui dois mutantes para a maioria dos genes³⁶. Informações sobre a p. aeruginosa PAO1 transposon mutant biblioteca estão disponíveis para o site do laboratório Manoil público, acessível pela internet em http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. A p. aeruginosa estirpe PA14 não redundante transposon inserção mutante biblioteca (conjunto PA14NR) construída em tensão PA14 usando transposões MAR2xT7 e TnphoA³⁷ atualmente é distribuída pelo departamento de Pediatria hospital geral de Massachusetts. O conjunto PA14NR é composto por uma coleção de mais de 5.800 mutantes com inserções de transposon único em genes não essenciais³⁷. Detalhes sobre a construção do Set PA14NR são descritos no http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB local público, acessível pela internet, que também contém uma variedade de ferramentas de busca on-line para facilitar o uso da PA14NR Conjunto.

O conjunto original de PA14NR composta por 5.459 mutantes, selecionados a partir de uma biblioteca abrangente de aproximadamente 34.000 transposon aleatório inserção mutantes, que correspondem a 4.596 genes PA14 previstos, representando 77% do PA14 previu todos os genes³⁷. Desde a construção da biblioteca em 2006 foram adicionados novos mutantes, e atualmente o conjunto de PA14NR inclui mais de 5.800 mutantes³⁸ que representam aproximadamente 4.600 PA14 genes. A maioria dos mutantes transposon PA14 foram gerada no selvagem tipo fundo³⁷. Pormenores relativos a cada membro da biblioteca mutante, incluindo a base genética, estão disponíveis através de pesquisa de banco de dados on-line ou baixando a planilha de biblioteca não redundante, ambos os recursos disponíveis no site PA14 (http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/Home.cgi). A maioria dos mutantes foram criada usando o MAR2xT7 transposon (MrT7), com um pequeno conjunto criado usando o TnPhoA (phoA) transposon³⁷. Cada transposon tem uma gaveta de resistência aos antibióticos, o que permite a seleção de mutantes usando gentamicina (MrT7) ou canamicina (phoA). O conjunto de PA14NR de mutantes é armazenado em sessenta e três placas de 96 poços e inclui controle de 96 poços adicionais duas placas, que consistem de tipo selvagem PA14 inoculadas e não inoculados poços intercalados em um padrão predefinido. O formato da placa de 96 poços emparelhado com as ferramentas de busca on-line muito facilita o desenvolvimento personalizado de ensaios que permitem aos usuários facilmente identificar genes associados com fenótipos mutantes de triagem. As ferramentas de busca on-line também facilitam a busca e seleção de mutantes de relevantes adicionais necessários para estudos adicionais.

As bibliotecas de mutante de transposon PA14 e PAO1 são muito importantes recursos globais para a comunidade científica, e eles se complementam na validação da função dos genes desconhecidos e os caminhos deste patógeno bacteriano. Coincidentemente, desde a construção das bibliotecas de mutação transposon PAO1 e PA14, análise de sequenciamento de DNA completo-genoma dos muitos isolados de p. aeruginosa mostrou que PAO1 e PA14 pertencem a diferentes subclados principais do P. aeruginosa ^7,de filogenia^39,40,41. Porque isolados clínicos de p. aeruginosa são encontrados distribuídos em toda a filogenia, o fato de que PAO1 e PA14 pertencem a diferentes p. aeruginosa subgrupos aumenta o valor das duas bibliotecas de mutação transposon para comparativo estudos.

Publicações descrevendo a construção e seleção de bactérias mutantes bibliotecas, incluindo p. aeruginosa bibliotecas^35,,37,⁴², estão prontamente disponíveis na literatura. No entanto, o melhor de nosso conhecimento, não há protocolos publicados descrevendo os procedimentos detalhados e técnicas usadas para replicação, manutenção e validação das bactérias mutantes bibliotecas estão disponíveis.

A metodologia descrita nesta publicação descreve um conjunto de três protocolos que facilitam o uso e manutenção do PA14NR Set. O primeiro protocolo descreve a replicação da biblioteca como recomendado aos destinatários da PA14NR Set. O segundo protocolo inclui diretrizes para estrias, crescendo e armazenar individuais mutantes identificados usando o conjunto de PA14NR. O terceiro protocolo descreve técnicas de controle de qualidade, incluindo a amplificação por PCR de fragmentos de mutantes transposon e posterior sequenciamento para confirmar identidade mutante. Este conjunto de protocolos também pode ser adaptado para a replicação e a manutenção de outras bibliotecas mutantes bacterianas ou coleções. A replicação de bactérias mutantes bibliotecas ou coleções é altamente recomendada para preservar a integridade da cópia do”mestre” (cópia original recebida). Replicação de várias cópias do conjunto de PA14NR para uso em laboratório de rotina minimiza a probabilidade de contaminação interwell da cópia mestre.