Replicación de la ordena, no redundante biblioteca de Pseudomonas aeruginosa cepa PA14 mutantes de inserción de transposones

Pseudomonas aeruginosa es una bacteria gramnegativa fenotípicamente y genotípicamente diversa y adaptable presente en suelo, agua y entornos más humanos, así como la microflora de la piel. Comparado a muchas especies bacterianas, p. aeruginosa tiene un genoma relativamente grande de 5.5-7 Mbp con alta G + C contenido (65-67%). Además, una proporción significativa de sus genes están implicada en la adaptación metabólica y forman parte de redes de regulación, permitiendo una gran flexibilidad en respuesta a estrés ambiental¹. P. aeruginosa expresa una gran cantidad de factores de virulencia, exhibe la propensión de forma biofilms, posee la capacidad de coordinar las respuestas a través de múltiples quórum sensing vías y muestra una notable capacidad para desarrollar resistencia a los antibióticos y tolerancia^{2,3,4,5,6,7,8}. Estos atributos presentan desafíos significativos para el tratamiento de infecciones causadas por p. aeruginosa.

Crónica infecciones de p. aeruginosa pueden ocurrir en numerosos Estados de la enfermedad. La fibrosis quística (FQ), una enfermedad genética causada por la mutación del gen Regulador de conductancia transmembrana de la Fibrosis Quística (CFTR) , resulta en secreciones inspissated, infectadas dentro de la vía aérea, bronquiectasia progresiva y, en última instancia, la muerte de insuficiencia respiratoria⁹. Por la edad adulta, la mayoría de los pacientes con FQ crónicamente infectada con p. aeruginosa, que juega un papel fundamental en la morbilidad y la mortalidad asociada con esta enfermedad¹⁰. Además, pacientes con quemaduras severas lesiones¹¹, las traqueotomías¹², reemplazo de la articulación¹³o residente catéteres¹⁴ están en riesgo de infección por p. aeruginosa relacionados con la capacidad de las bacterias para formar biofilms y escape host las respuestas inflamatorias¹⁵. Además, la colonización se produce sin competencia después de haber seleccionado una población tolerante o resistente a múltiples antibiótico a través de tratamiento antimicrobiano de amplio espectro, secuencial^{12,16,17 , 18}. mejor comprensión de la patogenesia de p. aeruginosa tendrá implicaciones significativas para muchos Estados de enfermedad.

Varios aislados clínicos de p. aeruginosa , incluyendo cepas PAO1, PA103, PA14 y PAK, se han estudiado extensivamente para investigar diferentes aspectos de la patogenia de p. aeruginosa . Cepa PA14 es un aislante clínico que pertenece a uno de los grupos clónicos más común en todo el mundo^19,20 y no ha sido extensivamente pasado en el laboratorio. PA14is altamente virulento en modelos de vertebrados de la infección, con una notable endotoxina perfil²¹, pili de la estructura²², patogenicidad de las islas²³, tipo sistema de secreción III (TTSS), citotoxicidad hacia mamíferos células²⁴ y perfiles de resistencia y persistencia antibiótico²⁵. Además, también es altamente virulenta en numerosos sistemas de modelo huésped-patógeno PA14, incluyendo hoja de infiltración modelos^26,27,elegans de Caenorhabditis infección modelos^{28, 29}, insecto modelos^30,31, así como neumonía de ratón modelos modelos de^32,33 y quemaduras en la piel³⁴.

Todo el genoma mutantes bibliotecas son colecciones de isogénicas mutantes en genes no esenciales que constituyen herramientas muy poderosas para entender la biología de un organismo permitiendo análisis de la función del gene en una escala genómica. Dos cerca de saturación transposon inserción mutante bibliotecas construidas en p. aeruginosa son actualmente disponibles para su distribución. Los sitios de inserción de los transposons han sido determinados para ambas bibliotecas. Estas bibliotecas no redundante supuestas facilitan estudios del genoma de las cepas bacterianas por disminuir considerablemente el tiempo y costo involucrados en investigación no caracterizados mutantes transposon al azar. La p. aeruginosa PAO1 transposon mutante biblioteca, construida en el MPAO1 aislar de la cepa PAO1 usando transposones esphoA/ hah eslacZy hah³⁵, está comisariada por el laboratorio de Manoil, Universidad de Washington. La biblioteca consiste en una colección de mutantes de transposon 9.437 verificado de secuencia que ofrece una cobertura amplia de genoma e incluye a dos mutantes para la mayoría de los genes de³⁶. Información sobre la biblioteca mutante de p. aeruginosa PAO1 transposón está disponible en la Web de laboratorio de Manoil, pública, accesible en la red, en http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. La p. aeruginosa cepa PA14 transposon no redundante inserción mutante biblioteca (conjunto PA14NR) construido en la cepa PA14 usando transposones MAR2xT7 y TnphoA³⁷ actualmente es distribuido por el Departamento de Pediatría en el Hospital General de Massachusetts. El conjunto de PA14NR se compone de una colección de más de 5.800 mutantes con inserciones de transposones solo en genes no esenciales³⁷. Detalles sobre la construcción del Set del PA14NR se describen en el sitio web público, accesible en la red http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, que también contiene una variedad de herramientas de búsqueda en línea para facilitar el uso de la PA14NR Conjunto.

El conjunto original de PA14NR compuesto por 5.459 mutantes, seleccionados a partir de una biblioteca de aproximadamente 34.000 transposon al azar inserción mutantes, que corresponden a 4.596 predijo genes PA14 representando el 77% de PA14 predijo todos los genes³⁷. Desde la construcción de la biblioteca en el año 2006 se agregaron nuevos mutantes, y actualmente el PA14NR incluye más de 5.800 mutantes³⁸ que representan aproximadamente 4.600 PA14 genes. La mayoría de los mutantes de transposon PA14 fueron generada en el fondo de tipo salvaje³⁷. Detalles relativos a cada miembro de la biblioteca de mutantes, incluyendo antecedentes genéticos, están disponibles mediante una búsqueda en la base de datos en línea o descargando la hoja de cálculo de la biblioteca no redundante, ambas características en la Web de PA14 (http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/Home.cgi). La mayoría de los mutantes fueron creada usando el MAR2xT7 transposon (MrT7), con un pequeño grupo creado con el TnPhoA (phoA) transposón³⁷. Cada transposón tiene una cinta de resistencia a los antibióticos, que permite la selección de mutantes con gentamicina (MrT7) o kanamicina (phoA). El conjunto PA14NR de mutantes se almacena en placas de 96 pocillos de sesenta y tres e incluye control de 96 pozos adicionales dos placas, que consisten en de tipo salvaje PA14 inoculadas y sin inocular pozos intercalan en un patrón preestablecido. El formato de la placa de 96 pocillos junto con las herramientas de búsqueda en línea grandemente facilita el desarrollo personalizado de investigación ensayos que permiten a los usuarios a identificar genes asociados a fenotipos mutantes. Las herramientas de búsqueda en línea también facilitan la búsqueda y selección de mutantes relevantes adicionales necesarios para estudios posteriores.

La PA14 PAO1 transposon mutante bibliotecas son recursos muy importantes para la comunidad científica, y se complementan en la validación de la función de genes desconocidos y las vías de este patógeno bacteriano. Coincidentemente, desde la construcción de las bibliotecas de mutación de transposon PAO1 y PA14, completo genoma DNA que ordenaba análisis de numerosos aislamientos de p. aeruginosa ha demostrado que PAO1 y PA14 pertenecen a diferentes grandes subclados de la P. aeruginosa filogenia^7,39,40,41. Debido a aislamientos clínicos de p. aeruginosa se encuentran distribuidos a lo largo de la filogenia, el hecho de que PAO1 y PA14 pertenecen a p. aeruginosa de diferentes subgrupos aumenta el valor de las dos bibliotecas de mutación de transposon de comparativo estudios.

Publicaciones que describen la construcción y proyección de las bibliotecas mutantes bacterianas incluyendo p. aeruginosa bibliotecas^35,37,42, están disponibles en la literatura. Sin embargo, al mejor de nuestro conocimiento, sin protocolos publicados que describen procedimientos y técnicas que se utilizan para la replicación, mantenimiento y validación de bibliotecas mutantes bacterianas están disponibles.

La metodología que se describe en esta publicación describe un conjunto de tres protocolos que faciliten el uso y mantenimiento de la PA14NR. El primer protocolo describe la replicación de la biblioteca como se recomienda a los destinatarios de la PA14NR. El segundo protocolo incluye directrices para rayas, cultivo y almacenamiento de mutantes individuales identificados usando el conjunto de PA14NR. El tercer Protocolo describe técnicas de control de calidad, incluyendo la amplificación por PCR de fragmentos de mutantes de transposon y secuenciación posterior para confirmar identidad mutante. Este conjunto de protocolos también puede ser adaptado para la replicación y el mantenimiento de otras colecciones o bibliotecas mutantes bacterianas. La replicación bacterianas mutantes bibliotecas o colecciones se recomienda altamente para preservar la integridad de la “copia maestra” (copia original recibido). Replicación de varias copias del juego de PA14NR para uso de laboratorio de rutina reduce al mínimo la probabilidad de contaminación interwell de la copia maestra.