緑膿菌は、多様な表現型と際と適応性グラム陰性菌で土壌、水、最も人間環境と皮膚の細菌叢に存在です。膿は、5.5-7 Mbp 高 G + c コンテンツ (65 〜 67%) の比較的大規模なゲノム多くの菌種に比べると。さらに、その遺伝子の大部分は代謝適応性に関与しているし、環境ストレス¹への応答に大きな柔軟性を可能にする規制のネットワークの一部であります。膿病原因子の茄多を表現、フォーム バイオ フィルムに性癖を展示、複数クオラムセンシングで経路を介して応答を調整する能力を持って、抗生物質耐性を開発する顕著な容量が表示されます。許容値^{2,3,4,5,6,7,8}。これらの属性は、膿によって引き起こされる感染症を治療するための重要な課題を提示します。

慢性的な膿菌感染は多くの病気の状態で発生することが。嚢胞性線維症 (CF)、嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR)遺伝子の変異によって引き起こされる遺伝病の結果、気道内で濃縮、感染した分泌物進歩的な気管支拡張症と、最終的には、死呼吸不全⁹。成人では、CF の患者の大半慢性膿、罹患率と死亡率のこの疾患¹⁰に関連付けられている重要な役割を果たしていると感染しています。さらに、重症熱傷の傷害¹¹、気管切開¹²、関節置換術¹³、または留置カテーテル¹⁴患者フォームする細菌の能力に関連するp. 緑膿菌感染のリスクがバイオ フィルムとエスケープ ホスト炎症反応¹⁵。多抗生物質耐性や寛容の人口は広域スペクトル、連続的抗菌薬治療^12,16,17によって選択後に、植民地化の競争がなければを発生するさらに、^,18.膿の病態の理解を深めるお越しの数多くの病気の状態に大きな影響を与えます。

PAO1、PA103、PA14、朴セリは、系統を含む、 P. 緑膿菌臨床分離株が盛ん膿病因のさまざまな機能を調査します。ひずみ PA14 は臨床分離株はない広範囲継研究室で最も一般的なクローンのグループ世界^19,20の 1 つに属しています。PA14is 顕著なエンドトキシンによる感染症の脊椎動物モデルにおける高度病原性プロファイル²¹、線毛構造²²、病原性島²³、タイプ III の分泌システム (TTSS)、哺乳類への毒性細胞²⁴と抗生物質抵抗性と永続性²⁵のプロファイル。さらに、PA14 はまた多数の宿主-病原体モデル システムにおける高度病原性植物葉を含む浸潤モデル^26,27,線虫感染モデル^{28, 29}昆虫モデル^30,31, と同様にマウス肺炎モデル^32,33皮の焼跡モデル³⁴。

ゲノム変異ライブラリ不要な遺伝子ゲノム規模での遺伝子機能の分析により有機体の生物学を理解するための非常に強力なツールを構成する同質遺伝子変異体のコレクションです。膿に建設された 2 つの飽和近くトランスポゾン挿入変異ライブラリは現在配布です。トランスポゾンの挿入サイトは、両方のライブラリの決定されています。これらのいわゆる非冗長ライブラリ時間がかなり短縮されて細菌菌株のゲノム研究を容易にし、コストに関わるスクリーニング, ランダムなトランスポゾン変異体。膿の PAO1 トランスポゾン変異ライブラリー、MPAO1 に建設された分離はトランスポゾンを用いた歪み PAO1phoA/ほら、lacZ/ほら³⁵がワシントン大学の Manoil 研究室によってキュレーションです。ライブラリのコレクションで構成、シーケンス確認 9,437 トランスポゾン変異体のゲノム広いカバレッジを提供し、ほとんどの遺伝子³⁶の 2 つの突然変異体が含まれています。膿PAO1 トランスポゾン変異ライブラリーに関する情報が http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm で公共のインターネットにアクセスできる Manoil ラボのウェブサイトでご利用いただけます。膿ひずみ PA14 非冗長トランスポゾン挿入変異ライブラリー (PA14NR セット) トランスポゾンMAR2xT7テネシー州phoAを用いた歪み PA14³⁷に建設された現在の配布は小児科学マサチューセッツ総合病院。PA14NR 設定には、不要な遺伝子³⁷単一トランスポゾン挿入 5,800 以上の突然変異体のコレクションが装備されています。PA14NR 設定の構成の詳細については、PA14NR の使用を促進するオンライン検索ツールのさまざまなを含む公共のインターネットからアクセスできるサイト http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB のとおり設定します。

オリジナル PA14NR セット約 34,000 ランダム トランスポゾン挿入変異体の 4,596 予測 PA14 遺伝子すべて予測 PA14 遺伝子³⁷の 77% を表すに対応する包括的なライブラリから選択された 5,459 変異株で構成されます。新しい突然変異体が追加された 2006 年に図書館の建設以来、現在約 4,600 PA14 遺伝子を表す 5,800 以上の変異体³⁸含まれている PA14NR の設定。PA14 トランスポゾン変異体の大半は、野生型背景³⁷に生成されました。遺伝的背景など、変異ライブラリーの各メンバーに関する詳細については、オンライン データベースを検索または非冗長ライブラリ スプレッドシート PA14 ウェブサイト (http:// で利用できる両方の機能をダウンロードすることによりpa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi)。突然変異体の大部分は、MAR2xT7 を使用して作成された (MrT7) トランスポゾンが TnPhoA (phoA) トランスポゾン³⁷を使用して作成された小さなセット。各トランスポゾンが抗生物質耐性カセット、ゲンタマイシン (MrT7) またはカナマイシン (phoA) を使用して突然変異体の選択を可能にします。突然変異体の PA14NR セット 63-96-ウェル プレートに格納され、2 つの追加の 96 ウェル制御プレート、野生型 PA14 から成っている接種が含まれています、プリセット パターンに挟在非接種の井戸。オンライン検索ツールとペアに大きく 96 ウェル プレート形式は、スクリーニング アッセイ突然変異体の表現型に関わる遺伝子を簡単に識別できるのカスタム開発を促進します。オンライン検索ツールには、検索してさらに研究に必要な追加の関連する変異体の選択も容易します。

PA14 と PAO1 トランスポゾン変異ライブラリは科学的なコミュニティのための非常に重要なグローバル リソースであり、彼らは未知の遺伝子の機能とこの細菌の病原体の経路を検証する際にお互いを補完します。偶然にも、PAO1 と PA14 トランスポゾン変異ライブラリの構築、以来多くの緑膿菌の全ゲノム DNA シーケンス解析を示している PAO1 と PA14 P. aeruginosa の別の主要なサブクレードに属しています。系統^7,39,40,41。臨床緑膿菌株が発見されてサブグループ系統、PAO1 と PA14 異なる膿に属している事実全体に分散比較 2 トランスポゾン変異ライブラリーの価値の向上研究。

文書構造を記述して膿ライブラリ^35,を含む細菌の突然変異体ライブラリのスクリーニング³⁷⁴²,^,、文献で容易に利用できます。しかし、我々 の知識の限りで公開プロトコルの詳細な手順と、レプリケーションに使用される技術を記述する保守、および細菌変異ライブラリの検証がありません。

この文書に記載されている方法では、使用を容易にする 3 つのプロトコルのセットと PA14NR セットのメンテナンスについて説明します。最初のプロトコルでは、PA14NR 設定の受信者にお勧めのライブラリのレプリケーションについて説明します。2 番目のプロトコルには、ストリー キング、成長、および PA14NR のセットを使用して識別される個々 の変異体を格納するためのガイドラインが含まれています。3 番目のプロトコルでは、トランスポゾン変異体からの断片の PCR の拡大や突然変異体の身元を確認するそれに続くシーケンスなど、品質管理手法について説明します。この一連のプロトコルは、レプリケーションおよび他の細菌の突然変異体のライブラリやコレクションの維持の適応もあります。細菌変異ライブラリやコレクションのレプリケーションは「マスター コピー」の整合性を維持するために非常にお勧め (原本を受け取った)。ルーチン検査用 PA14NR セットの複数のコピーのレプリケーションでは、マスター コピーの間の汚染の可能性を最小限に抑えます。