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Imunologia e Infecção

आदेशित, अनावश्यक लायब्रेरी की प्रतिकृति Pseudomonas aeruginosa तनाव PA14 Transposon लन म्यूटेंट

Published: May 04, 2018
doi:
10.3791/57298
, , , , , , ,
1Department of Pediatrics, Mucosal Immunology and Biology Research Center,Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology,Massachusetts General Hospital, 3Department of Genetics,Harvard Medical School, 4Department of Pediatrics,Harvard Medical School

Summary

Pseudomonas aeruginosa संक्रमण कमजोर मेजबान में महत्वपूर्ण रुग्णता का कारण बनता है । पी aeruginosa तनाव PA14 के निरर्थक transposon प्रविष्टि उत्परिवर्ती पुस्तकालय, PA14NR सेट के रूप में नामित, कई प्रक्रियाओं में जीन की कार्यक्षमता के विश्लेषण की सुविधा । यहां प्रस्तुत एक PA14NR सेट उत्परिवर्ती पुस्तकालय के उच्च गुणवत्ता प्रतियां उत्पंन प्रोटोकॉल है ।

Abstract

Pseudomonas aeruginosa मानव वातावरण में एक phenotypically और genotypically विविध तथा रूपांतरित ग्राम-ऋणात्मक जीवाणु सर्वव्यापक है. पी. aeruginosa , एंटीबायोटिक प्रतिरोध विकसित करने, डाह कारकों का उत्पादन और तेजी से एक पुरानी संक्रमण के पाठ्यक्रम में विकसित करने के लिए कर सकते हैं । इस प्रकार P. aeruginosa दोनों तीव्र और जीर्ण, संक्रमण का इलाज करने के लिए मुश्किल है, कुछ रोगी आबादी में महत्वपूर्ण रुग्णता में जिसके परिणामस्वरूप हो सकता है । पी aeruginosa तनाव PA14 एक मानव नैदानिक एक संरक्षित जीनोम संरचना है कि स्तनधारी और nonvertebrate इस रोगज़नक़ अध्ययन के लिए एक आकर्षक तनाव PA14 बनाने के मेजबान की एक किस्म को संक्रमित के साथ अलग है । २००६ में, एक निरर्थक transposon प्रविष्टि उत्परिवर्ती पुस्तकालय ५,४५९ म्यूटेंट इसी ४,५९६ की भविष्यवाणी की PA14 जीन उत्पंन किया गया था । तब से, PA14 पुस्तकालय के वितरण के अनुसंधान समुदाय को बेहतर व्यक्तिगत जीन और पी aeruginosaके जटिल रास्ते के समारोह को समझने की अनुमति दी गई है । प्रतिकृति प्रक्रिया के माध्यम से पुस्तकालय अखंडता के रखरखाव उचित हैंडलिंग और सटीक तकनीक की आवश्यकता है । कि अंत करने के लिए, इस पांडुलिपि प्रोटोकॉल है कि विस्तार से पुस्तकालय प्रतिकृति, पुस्तकालय गुणवत्ता नियंत्रण और व्यक्तिगत म्यूटेंट के उचित भंडारण में शामिल कदम का वर्णन प्रस्तुत करता है ।

Introduction

Pseudomonas aeruginosa मिट्टी, पानी, और सबसे अधिक मानव वातावरण में एक phenotypically और genotypically विविध और अनुकूलनीय ग्राम नकारात्मक जीवाणु मौजूद है, साथ ही त्वचा माइक्रोफ्लोरा । कई बैक्टीरियल प्रजातियों की तुलना में, पी aeruginosa उच्च जी + सी सामग्री (65-67%) के साथ 5.5-7 Mbp के एक अपेक्षाकृत बड़े जीनोम है । इसके अलावा, अपने जीन का एक महत्वपूर्ण अनुपात चयापचय अनुकूलन क्षमता में शामिल है और विनियामक नेटवर्क का हिस्सा हैं, पर्यावरण तनाव के जवाब में महान लचीलेपन के लिए अनुमति1। पी aeruginosa डाह कारकों में से एक बहुतायत व्यक्त करता है, प्रदर्शन proclivity के लिए फार्म का, कई कोरम संवेदन रास्ते के माध्यम से प्रतिक्रियाओं का समंवय करने की क्षमता के पास, और एंटीबायोटिक प्रतिरोध विकसित करने के लिए एक उल्लेखनीय क्षमता प्रदर्शित और सहिष्णुता2,3,4,5,6,7,8। ये विशेषताएं मौजूद P. aeruginosaकी वजह से संक्रमण के उपचार के लिए महत्वपूर्ण चुनौतियां हैं ।

जीर्ण पी aeruginosa संक्रमण कई रोग राज्यों में हो सकता है । सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF), एक आनुवंशिक सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane कंडक्टर नियामक (CFTR) जीन के उत्परिवर्तन की वजह से बीमारी, उपयोग inspissated में परिणाम, airway के भीतर संक्रमित स्राव, प्रगतिशील bronchiectasis और, अंत में, मौत सांस की विफलता से9। वयस्कता से, CF के साथ रोगियों के बहुमत लंबे aeruginosaहै, जो इस बीमारी के साथ जुड़े रुग्णता और मृत्यु दर में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है से संक्रमित हैं10. इसके अतिरिक्त, गंभीर चोटों के साथ रोगियों को11, tracheostomies12, संयुक्त प्रतिस्थापन13, या निवास कैथेटर्स14 के रूप में बैक्टीरिया की क्षमता से संबंधित पी aeruginosa संक्रमण के लिए जोखिम में हैं फिल्म और भागने की मेजबानी भड़काऊ प्रतिक्रियाएं15। इसके अलावा, औपनिवेशीकरण एक बहु के बाद प्रतियोगिता के बिना होता है-एंटीबायोटिक प्रतिरोधी या सहिष्णु जनसंख्या व्यापक स्पेक्ट्रम के माध्यम से चुना जाता है, अनुक्रमिक रोगाणुरोधी उपचार12,16,17 , 18. बेहतर समझ पी aeruginosa के रोगजनन कई रोग राज्यों के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ होगा ।

उपभेदों PAO1, PA103, PA14 और पाक सहित कई aeruginosa नैदानिक अलग-अलग, पी aeruginosa रोगजनन के विभिन्न सुविधाओं की जांच करने के लिए बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है. तनाव PA14 एक नैदानिक अलग है कि दुनिया भर में सबसे आम क्लोनर समूहों में से एक के लिए है,20 और बड़े पैमाने पर प्रयोगशाला में पारित नहीं किया गया है । PA14is संक्रमण के हड्डीवाला मॉडलों में अत्यधिक विषमय, एक उल्लेखनीय endotoxin प्रोफ़ाइल के साथ21, पिली संरचना22, pathogenicity आइलैंड्स23, टाइप III स्राव प्रणाली (TTSS), cytotoxicity की ओर स्तनधारी कोशिकाओं24 और एंटीबायोटिक प्रतिरोध और हठ25में प्रोफाइल । इसके अलावा, PA14 भी कई मेजबान में अत्यधिक विषमय है-रोगज़नक़ मॉडल प्रणालियों, संयंत्र पत्ती घुसपैठ मॉडल सहित26,27,Caenorhabditis एलिगेंस संक्रमण मॉडल28, 29, कीट मॉडल30,31, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से माउस निमोनिया मॉडल३२,३३ और त्वचा जला मॉडल३४।

जीनोम-वाइड उत्परिवर्ती पुस्तकालयों isogenic म्यूटेंट के अनावश्यक जीन है कि बहुत शक्तिशाली उपकरण का गठन एक जीनोमिक पैमाने पर जीन समारोह के विश्लेषण की अनुमति से एक जीव के जीव विज्ञान को समझने में संग्रह कर रहे हैं । दो के पास-संतृप्ति transposon लन उत्परिवर्ती पुस्तकालयों का निर्माण P. aeruginosa में वर्तमान में वितरण के लिए उपलब्ध हैं । दोनों पुस्तकालयों के लिए transposons के सम्मिलन स्थलों का निर्धारण किया गया है. इन तथाकथित निरर्थक पुस्तकालयों काफी समय और लागत uncharactered यादृच्छिक transposon म्यूटेंट स्क्रीनिंग में शामिल कम से बैक्टीरियल उपभेदों के जीनोम चौड़ा अध्ययन की सुविधा । पी aeruginosa PAO1 transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालय, तनाव PAO1 के MPAO1 अलग में निर्माण transposons का उपयोग करphoA/hah है औरlacZ/hah३५, Manoil लैब, वाशिंगटन विश्वविद्यालय द्वारा उपचारात्मक है । पुस्तकालय ९,४३७ transposon म्यूटेंट की एक अनुक्रम सत्यापित संग्रह है कि व्यापक जीनोम कवरेज प्रदान करता है और सबसे जीन३६के लिए दो म्यूटेंट शामिल हैं । पी. aeruginosa PAO1 transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालय के बारे में जानकारी सार्वजनिक, इंटरनेट-सुलभ Manoil लैब वेबसाइट पर http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm पर उपलब्ध है । पी aeruginosa तनाव PA14 बेमानी transposon प्रविष्टि उत्परिवर्ती पुस्तकालय (PA14NR सेट) का निर्माण में तनाव PA14 का उपयोग transposons MAR2xT7 और तमिलनाडुphoA३७ वर्तमान में बाल रोग विभाग द्वारा वितरित किया जाता है मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल में । PA14NR सेट में एकल transposon सम्मिलन के साथ ५,८०० से अधिक म्यूटेंट का संग्रह शामिल है जो कि अनावश्यक जीन३७में है. PA14NR सेट के निर्माण पर विवरण सार्वजनिक, इंटरनेट-सुलभ साइट http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, जो भी ऑनलाइन खोज उपकरण की एक किस्म शामिल है में वर्णित है PA14NR के उपयोग की सुविधा सेट.

मूल PA14NR सेट ५,४५९ म्यूटेंट, लगभग ३४,००० यादृच्छिक transposon प्रविष्टि म्यूटेंट, कि ४,५९६ की भविष्यवाणी की PA14 जीन सभी के ७७% का प्रतिनिधित्व करने के लिए अनुरूप की एक व्यापक पुस्तकालय से चुना शामिल सभी की भविष्यवाणी की PA14 जीन३७। २००६ नए म्यूटेंट में पुस्तकालय के निर्माण के बाद से जोड़ा गया है, और वर्तमान में PA14NR सेट से अधिक ५,८०० म्यूटेंट३८ है कि लगभग ४,६०० PA14 जीन का प्रतिनिधित्व शामिल हैं । PA14 transposon म्यूटेंट के बहुमत जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि३७में उत्पंन किया गया । आनुवंशिक पृष्ठभूमि सहित उत्परिवर्ती पुस्तकालय के प्रत्येक सदस्य के विषय में विवरण, ऑनलाइन डेटाबेस खोज के माध्यम से या तो उपलब्ध हैं, या अनावश्यक पुस्तकालय स्प्रेडशीट डाउनलोड करके, दोनों PA14 वेबसाइट पर उपलब्ध सुविधाओं (http:// pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi) । म्यूटेंट के बहुमत MAR2xT7 (MrT7) transposon, एक छोटे से TnPhoA (phoA) transposon३७का उपयोग कर बनाया सेट के साथ का उपयोग कर बनाया गया. प्रत्येक transposon एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट है, जो उत्परिवर्ती चयन gentamicin (MrT7) या कनमीसिन (phoA) का उपयोग करने के लिए अनुमति देता है । म्यूटेंट के PA14NR सेट ६३ ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में संग्रहित है और दो अतिरिक्त ९६-अच्छी तरह से नियंत्रण प्लेटें, जो जंगली प्रकार PA14 inoculated और uninoculated वेल्स intercalated से मिलकर एक पूर्व निर्धारित पैटर्न में शामिल है । ९६-अच्छी तरह से प्लेट ऑनलाइन खोज उपकरण के साथ युग्मित प्रारूप बहुत स्क्रीनिंग परख कि प्रयोक्ताओं को आसानी से उत्परिवर्ती phenotypes के साथ जुड़े जीन की पहचान करने की अनुमति के कस्टम विकास की सुविधा । ऑनलाइन खोज उपकरण भी खोज और अतिरिक्त प्रासंगिक म्यूटेंट आगे की पढ़ाई के लिए आवश्यक के चयन की सुविधा ।

PA14 और PAO1 transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालयों वैज्ञानिक समुदाय के लिए बहुत महत्वपूर्ण वैश्विक संसाधन हैं, और वे अज्ञात जीन और इस जीवाणु रोगज़नक़ के रास्ते के समारोह को मांय करने में एक दूसरे के पूरक हैं । संयोग से, PAO1 और PA14 transposon उत्परिवर्तन पुस्तकालयों के निर्माण के बाद से, पूर्ण जीनोम कई पी. aeruginosa के डीएनए अनुक्रमण विश्लेषण से पता चला है कि PAO1 और PA14 के विभिंन प्रमुख पी aeruginosa से संबंधित है फाइलोजेनी7,३९,४०,४१. क्योंकि नैदानिक पी aeruginosa अलग फाइलोजेनी भर में वितरित पाए जाते हैं, तथ्य यह है कि PAO1 और PA14 विभिंन पी aeruginosa उपसमूह के है तुलनात्मक के लिए दो transposon उत्परिवर्तन पुस्तकालयों के मूल्य को बढ़ाता है अध्ययन.

प्रकाशन P. aeruginosa पुस्तकालयों३५,३७,४२सहित बैक्टीरियल उत्परिवर्ती पुस्तकालयों, के निर्माण और स्क्रीनिंग का वर्णन साहित्य में आसानी से उपलब्ध हैं । हालांकि, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, कोई प्रकाशित विस्तृत प्रक्रियाओं और तकनीक प्रतिकृति, रखरखाव, और बैक्टीरियल उत्परिवर्ती पुस्तकालयों के सत्यापन के लिए इस्तेमाल किया उपलब्ध है प्रोटोकॉल का वर्णन ।

पद्धति इस प्रकाशन में उल्लिखित तीन प्रोटोकॉल का उपयोग करें और PA14NR सेट के रखरखाव की सुविधा का एक सेट का वर्णन करता है । पहले प्रोटोकॉल PA14NR सेट के प्राप्तकर्ताओं के लिए अनुशंसित के रूप में लायब्रेरी की प्रतिकृति का वर्णन करता है । दूसरा प्रोटोकॉल लकीर के लिए दिशानिर्देश, बढ़ रही है, और PA14NR सेट का उपयोग कर पहचान व्यक्तिगत म्यूटेंट भंडारण शामिल है । तीसरे प्रोटोकॉल का वर्णन गुणवत्ता नियंत्रण तकनीक, transposon म्यूटेंट और बाद अनुक्रमण से टुकड़े की पीसीआर प्रवर्धन सहित उत्परिवर्ती पहचान की पुष्टि करने के लिए । प्रोटोकॉल का यह सेट भी प्रतिकृति और अंय बैक्टीरियल उत्परिवर्ती पुस्तकालयों या संग्रह के रखरखाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । बैक्टीरियल उत्परिवर्ती पुस्तकालयों या संग्रह की प्रतिकृति उच्च “मास्टर कॉपी” (मूल प्रतिलिपि प्राप्त) की अखंडता को बनाए रखने के लिए सलाह दी जाती है । नियमित प्रयोगशाला उपयोग के लिए PA14NR सेट की कई प्रतियां की प्रतिकृति मास्टर प्रति के साथ-साथ संदूषण की प्रायिकता को कम करता है ।

Protocol

चेतावनी: पी aeruginosa, एक मानव रोगज़नक़ हैंडलिंग जब मानक बीएसएल-2 सुरक्षा उपायों का उपयोग । यदि आप एक प्रतिरक्षा व्यक्ति है या किसी भी चिकित्सा शर्त है कि जीवाणु संक्रमण के लिए अपने संवेदनशीलता बढ़ जाती ह?…

Representative Results

PA14NR सेट की बारह नई प्रतियां प्रोटोकॉल I का उपयोग करते हुए दोहराया गया था, और एक गुणवत्ता नियंत्रण मूल्यांकन नई प्रतियां उत्पंन की प्रोटोकॉल III का उपयोग कर आयोजित किया गया था । <p class="jove_content" fo:keep-togethe…

Discussion

पी. aeruginosa PA14NR सेट वैज्ञानिक समुदाय के लिए एक मूल्यवान संसाधन है । मार्च २०१७ के अनुसार Clarivate ‘ विश्लेषिकी आवश्यक विज्ञान संकेतक डाटाबेस से डेटासेट, Liberati एट अल । (२००६) ३७, जो PA14NR सेट के निर्माण …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम उसे डेटाबेस खोज में मार्गदर्शन के लिए MGH Treadwell आभासी पुस्तकालय की लिसा Philpotts शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस काम को सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (YONKER16G0 and HURLEY16G0) और NIH NIAID (BPH and ADE: R01 A1095338) ने सपोर्ट किया ।

Materials

Materials for Library Replication
Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50 Corning Life Sciences 353072 via Fisher Scientific
Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μL Deep Well Plates, case of 25 Corning Life Sciences 3960 via Fisher Scientific
Nunc OmniTray (rectangular plates), case of 60 Thermo Scientific Rochester 242811 via Fisher Scientific
Rectangular Ice Pan, Midi (4L) Corning Life Sciences 432104 via Fisher Scientific
Secure-Gard Cone Mask, case of 300 Cardinal Health AT7509 via Fisher Scientific
AluminaSeal, pack of 100 Diversified Biotech ALUM-100 via Fisher Scientific
Breathe-Easy membrane, pack of 100 Diversified Biotech BEM-1 via Sigma-Aldrich
Sterile, individually wrapped, 50mL Solution Trough/Reagent Reservoir, case of 100 Sorenson S50100 via Westnet Incorporated
Plate roller VWR 60941-118 via VWR
Cryo Laser Labels – CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", pack of 16 sheets GA International RCL-11T1-WH via Labtag.com (template for printing also available from Labtag.com)
96-well replicator V & P Scientific, Inc. Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm long via V & P Scientific, Inc.
Multitron Pro, 3mm Shaking incubator Infors HT l10003P via Infors HT
Picus 12 Channel 50-1200μL Electronic Pipette Sartorius 735491PR via Sartorius
Filter Tips 50-1200μL, pack of 960 Biohit 14-559-512 via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips
Dry Ice User-specific vendor
Materials for Individual Mutant Storage
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Materials for Quality Control PCR
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000 via ThermoFisher
PCR Thermocycler
Omnistrips PCR Tubes with domed lids Thermo Scientific AB0404 via Fisher Scientific
ART Barrier low-retention pipette tips (10 uL, 100 uL, 1000 uL) Molecular BioProducts, Inc. Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL) via Sigma-Aldrich
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
MasterPure DNA Purification Kit Epicentre MCD85201 via Epicentre Technologies Corp
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use Thermo Scientific SM1333 via ThermoFisher
RediLoad Loading Buffer Invitrogen 750026 via ThermoFisher
Chemicals
Chemicals for Library and Individual Mutant Storage
Glycerol MB Grade, 1L Sigma Aldrich G5516 via Sigma-Aldrich
LB Broth Per 1L dH2O: 10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology.  Wiley, 1994.)
Tryptone Sigma Aldrich T7293 via Sigma-Aldrich
Yeast Extract Sigma Aldrich Y1625 via Sigma-Aldrich
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653 via Sigma-Aldrich
Sodium Hydroxide Sigma Aldrich S8045 via Sigma-Aldrich
LB  agar See preparation above, add 15g Bacto Agar
Bacto Agar Sigma Aldrich A5306 via Sigma-Aldrich
Gentamicin sulfate, 10g BioReagent 1405-41-0 via Sigma-Aldrich
Kanamycin sulfate Gibco 11815024 via ThermoFisher
Ethanol, 190 proof Decon 04-355-221 via Fisher Scientific
Chemicals for Quality Control PCR
Primers User-preferred vendor See primers listed in Table 3
Corning cellgro Molecular Biology Grade Water Corning 46000CV via Fisher Scientific
Taq Polymerase Buffer Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
Taq DNA Polymerase, recombinant Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
dNTPs Invitrogen 10297018 via ThermoFisher
Agarose Sigma A9539 via Sigma-Aldrich
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Drenkard, E., Hibbler, R. M., Gutu, D. A., Eaton, A. D., Silverio, A. L., Ausubel, F. M., Hurley, B. P., Yonker, L. M. Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants. J. Vis. Exp. (135), e57298, doi:10.3791/57298 (2018).
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