Pseudomonas aeruginosa er en fænotype og genotypisk forskelligartede og tilpasningsdygtige Gram-negative bakterien findes i jord, vand, og de fleste menneskelige miljøer samt hud mikroflora. Sammenlignet med mange bakteriearter, har P. aeruginosa et relativt stort genom af 5,5-7 Mbp med høj G + C indhold (65-67%). Desuden en betydelig del af dets gener er involveret i metaboliske tilpasningsevne og er en del af regulerende net, giver mulighed for stor fleksibilitet i respons til miljøstress¹. P. aeruginosa udtrykker en overflod af virulens faktorer, udstiller hang til form biofilm, besidder evnen til at koordinere svar gennem flere quorum sensing veje og viser en bemærkelsesværdig evne til at udvikle resistens over for antibiotika og tolerance^{2,3,4,5,6,7,8}. Disse attributter præsentere betydelige udfordringer til behandling af infektioner forårsaget af P. aeruginosa.

Kronisk P. aeruginosa infektioner kan opstå i mange sygdomstilstande. Cystisk fibrose (CF), en genetisk sygdom forårsaget af mutation af genet Cystisk fibrose Transmembrane ledningsevne Regulator (CFTR) resulterer i inspissated, inficerede sekret i luftvejene, progressive bronchiectasis og i sidste ende, død fra respirationssvigt⁹. Af voksenalderen, er størstedelen af patienter med CF kronisk inficeret med P. aeruginosa, som spiller en central rolle i sygelighed og dødelighed forbundet med denne sygdom¹⁰. Derudover, er patienter med svær brænde skader¹¹, tracheostomies¹², ledalloplastik¹³eller iboende katetre¹⁴ i risiko for P. aeruginosa infektion relateret til bakteriernes evne til at danne biofilm og undslippe vært inflammatoriske respons¹⁵. Yderligere, kolonisering opstår uden konkurrence efter en multi antibiotika-resistente eller tolerant befolkning er valgt gennem bredspektret, sekventiel antimikrobiel behandling^{12,16,17 , 18}. bedre forståelse af P. aeruginosa’s patogenese vil få betydelige følger for adskillige sygdomstilstande.

Flere P. aeruginosa kliniske isolater, herunder stammer PAO1, PA103, PA14 og PAK, er blevet grundigt undersøgt for at undersøge forskellige funktioner af P. aeruginosa patogenese. Stamme PA14 er en klinisk isolat, der hører til en af de mest almindelige klonede grupper verden over^19,20 og ikke har været omfattende passaged i laboratoriet. PA14is stærkt virulente i hvirveldyr modeller af infektion med en bemærkelsesværdig endotoxin profil²¹, pili strukturere²², patogenicitet øer²³, Skriv III sekretion system (TTSS), cytotoksicitet mod pattedyr celler²⁴ og profiler i antibiotisk resistens og persistens²⁵. Derudover PA14 er også stærkt virulente i talrige vært-patogen modelsystemer, herunder plante blad infiltration modeller^26,27,Caenorhabditis elegans infektion modeller^{28, 29}, insekt modeller^30,31, samt mus lungebetændelse modeller^32,33 og hud brænde modeller³⁴.

Genome-wide mutant biblioteker er samlinger af isogene mutanter i uvæsentlige gener, der udgør meget kraftfulde værktøjer til at forstå i en organisme biologi ved at tillade analyse af genfunktioner på en genomisk skala. To nær-mætning transposon indsættelse mutant biblioteker bygget i P. aeruginosa er i øjeblikket tilgængelig for distribution. Indsættelse lokaliteter af transposoner er blevet fastsat for begge biblioteker. Disse såkaldte nonredundant biblioteker lette genome-wide undersøgelser af bakteriestammer af væsentligt reducere tid og omkostninger, der er involveret i screening uncharacterized tilfældige transposon mutanter. P. aeruginosa PAO1 transposon mutant biblioteket, bygget i MPAO1 isolere stamme PAO1 ved hjælp af transposoner erphoA/ hah og erlacZ/ hah³⁵, er kurateret af Manoil lab, University of Washington. Biblioteket består af en sekvens-verificerede samling af 9,437 transposon mutanter, der giver bred genom dækning og omfatter to mutanter for de fleste gener³⁶. Oplysninger om P. aeruginosa PAO1 transposon mutant biblioteket er tilgængelig på den offentlige, internet-adgang Manoil lab hjemmeside på http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. P. aeruginosa stamme PA14 nonredundant transposon indsættelse mutant bibliotek (PA14NR indstille) fremstillet i stammen PA14 ved hjælp af transposoner MAR2xT7 og TnphoA³⁷ er i øjeblikket distribueres af Department of Pediatrics på Massachusetts General Hospital. PA14NR sæt består af en samling af mere end 5.800 mutanter med enkelt transposon indsættelser i uvæsentlige gener³⁷. Detaljer om opførelsen af PA14NR sæt er beskrevet i den offentlige, internet-adgang site http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, som også indeholder en bred vifte af online værktøjer til at lette anvendelsen af PA14NR Sæt.

Den oprindelige PA14NR Set består 5,459 mutanter, udvalgt fra et omfattende bibliotek af cirka 34.000 tilfældige transposon indsættelse mutanter, der svarer til 4,596 forudsagte PA14 gener der repræsenterer 77% af alle forudsagte PA14 gener³⁷. Siden opførelsen af biblioteket i 2006 blev der tilføjet nye mutanter, og i øjeblikket PA14NR sættet indeholder mere end 5.800 mutanter³⁸ , der repræsenterer ca. 4.600 PA14 gener. Fleste af PA14 transposon mutanter blev genereret i vildtype baggrund³⁷. Oplysninger om hvert medlem af biblioteket mutant, herunder genetiske baggrund, er tilgængelig enten via søgning online database eller ved at downloade Nonredundant bibliotek regnearket, begge funktioner på webstedet PA14 (http:// pa14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/pa14/Home.cgi). Fleste af mutanter var skabt benytter MAR2xT7 (MrT7) transposon, med et lille sæt oprettet ved hjælp af TnPhoA (phoA) transposon³⁷. Hver transposon har en antibiotisk resistens kassette, som giver mulighed for mutant markeringen ved hjælp af gentamicin (MrT7) eller kanamycin (phoA). PA14NR sæt af mutanter er gemt i 63 96-brønd plader og omfatter to yderligere 96-brønd kontrol plader, der består af vildtype PA14 podes og utilsåede wells imidlerid i en forudindstillet mønster. 96-brønd plade format parret med online søgeredskaber høj grad letter den brugerdefinerede udvikling af screening assays, der giver brugerne til nemt at identificere gener forbundet med mutant fænotyper. Online-søgning værktøjer også lette søgning og udvælgelse af yderligere relevante mutanter kræves for yderligere undersøgelser.

De PA14 og PAO1 transposon mutant biblioteker er meget vigtige globale ressourcer for forskerverdenen, og de supplerer hinanden i validering af funktionen af ukendt gener og veje på dette bakteriel patogen. Tilfældigvis, siden opførelsen af PAO1 og PA14 transposon mutation bibliotekerne, har fuld-genom DNA-sekventering analyse af mange P. aeruginosa -isolater vist at PAO1 og PA14 tilhører forskellige større subclades af P. aeruginosa fylogeni^7,39,40,41. Fordi kliniske P. aeruginosa -isolater findes fordelt i hele fylogeni, det faktum, at PAO1 og PA14 tilhører forskellige P. aeruginosa undergrupper øger værdien af de to transposon mutation biblioteker for sammenlignende undersøgelser.

Publikationer, der beskriver opbygningen og screening af bakteriel mutant biblioteker, herunder P. aeruginosa biblioteker^35,er^37,42, let tilgængelige i litteraturen. Dog til bedst af vores viden, ingen publicerede protokoller der beskriver detaljerede procedurer og teknikker, der anvendes til replikering, er vedligeholdelse og validering af bakteriel mutant biblioteker tilgængelige.

Den metode, der er skitseret i denne publikation beskriver et sæt af tre protokoller, der letter brug og vedligeholdelse af PA14NR sæt. Den første protokol beskriver replikering af biblioteket som anbefalet til modtagere af PA14NR sæt. Den anden protokol omfatter retningslinjer for striber, voksende, og opbevaring individuelle mutanter identificeret ved hjælp af PA14NR sæt. Den tredje protokol beskriver kvalitetskontrol teknikker, herunder PCR-amplifikation af fragmenter fra transposon mutanter og efterfølgende sekventering at bekræfte mutant identitet. Dette sæt af protokoller kan også tilpasses til replikering og vedligeholdelse af andre bakterielle mutant biblioteker eller samlinger. Replikering af bakteriel mutant biblioteker eller samlinger er stærkt tilrådes at bevare integriteten af “masterkopien” (original kopi modtaget). Replikering af flere kopier af PA14NR angive til rutinemæssige laboratoriebrug minimerer sandsynligheden for interwell kontaminering af masterkopi.