在这里, 我们提出了一个协议, 以获得 3 d-培养系统的自组装肽支架, 以促进分化去分化肉瘤人关节软骨细胞成软骨样组织。
介绍了一种在自组装碳纤维三维 (3D) 支架上培养细胞的有效方法。这种文化系统再现了一个紧密模仿非极化组织结构特征的环境。此外, 该脚手架的独特的内在碳纤维结构使其透明的视觉光, 这使得在显微镜下容易可视化的样品。这一优势主要用于研究细胞的迁移、组织、增殖和分化, 从而使其特定的细胞功能通过染色或探针来发展。此外, 在这项工作中, 我们描述了良好的性能, 这一系统, 以方便地研究扩大人关节软骨细胞分化软骨组织。细胞被封装成自组装肽支架, 并在特定条件下培养, 以促进软骨。在实验的4周内, 三维文化表现出良好的生存能力。如所料, 用软骨诱导剂 (相对于非诱导控制) 培养的样品对甲苯胺蓝 (在软骨细胞外基质中高度存在的污渍多糖 (堵嘴)) 染色强烈阳性, 并表达具体的分子标记, 包括胶原 i 型, II 和 X, 根据西方印迹分析。该协议易于执行, 可用于实验室、工业和实验课程的教育目的。
几十年来, 哺乳动物细胞培养是在实验条件下使用经典的二维 (2D) 文化系统, 由于实际和经济问题, 无论非生理方面。虽然这种文化体系有助于研究和理解大多数分子和细胞机制, 但我们今天知道, 需要新的细胞培养范式来研究更复杂的细胞系统。因此, 需要三维 (3D) 培养系统来重建一种 biophysically、biomechanically 和生物学上与自然组织相似的微环境。近年来, 3D 的文化体系, 总的来说, 在研究人员和工业界中变得越来越普遍, 因为它们代表了一种新的研究或筛选模式, 细胞可以在空间中生长, 形成细胞对细胞或细胞对矩阵的相互作用, 迁移和最终分化为特定的细胞血统。
这种方法的总体目标是重建离体内微环境更近的体外细胞微环境。特别是合成自组装肽支架 (sap) 是一种具有独特性质的生物材料;它形成了一个纳米级的孔隙网络, 由多肽之间的弱相互作用组成, 其力学和结构性质类似于自然细胞外基质。换言之, 使用这种材料的合理性是, 它创造了一个真正的3维环境, 是理想的获得 pseudo-3D 组织或器官单位。然而, 最重要的是, 3D 上下文允许3D 结构获得新的生物学功能, 通常不存在于2D 文化平台, 如与组织结构, 质量转移现象, 细胞模式和最终的属性组织形态发生是未来功能性组织和器官研究和发展的关键因素1、2。此外, 在他们的天然对应物 (胶原蛋白, 胶) 的优点是, 它们在室温下非常稳定, 不需要特殊条件的后期生产, 分配或存储3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. 在需要时易于处理结构调整;3D 凝胶可以通过增加离子强度或调整 pH 值到中性1,2来简单地得到。最后, 本文所描述的方法已广泛应用于体外促进多种细胞类型的维持、生长和分化, 包括软骨细胞、肝细胞、血管内皮、成骨细胞、神经细胞以及胚胎和体细胞干细胞3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. 在目前的工作中, 我们描述了使用一个 3 d-培养系统, 以区分人的扩大关节软骨细胞 (hACh) 成软骨样组织如前所述11。
本文介绍了一种使用结构模型对3D 系统中的细胞进行培养的方法。在这种合成生物材料中, 细胞首先与肽溶液混合, 随后诱导自组装, 在细胞周围创建一个纳米尺寸网络, 从而创造出真正的3D 环境 (图 1)。重要的是要考虑到细胞的行为受到矩阵刚度值 (即扩散, 迁移和分化) 的影响。因此, 一个共同的方法控制是培养细胞上的肽脚手架上具有相同的刚度值 (文化在两个维度)。
以前, 我们的小组和其他人已经描述了使用三维 (3D) 文化平台与不同的细胞系统3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15。在目前的工作中, 我们描述了一种简单可靠的方法来获得3D 培养系统, 适用于任何类型的哺乳动物细胞, 包括任何类型的功能细胞, 胚胎或成体干细胞, 或最终, 功能失调的细胞分离活检或肿瘤等.另外, 独立地, 如果干细胞是胚胎或成人起源他们将有更好的血统承诺容量在3D 环境比在古典2D 文化菜10,11,12, 13,14,15。因此, 该系统的细胞培养将导致分化为功能性组织样结构, 可用于不同的应用, 从修复或再生生物医学的毒理学和药理学平台。
由于细胞微环境与自然组织在基质结构和生物力学、生物物理和生物学参数等方面的相似, 我们在细胞功能上显示出明显的增益。然而, 随着系统变得更加复杂, 需要调节的参数数量也在增加, 其中包括需要一个外部支撑平台 (如主动灌注系统以避免传质现象-相关问题).三维培养细胞在调节基本活动, 如移徙、增殖和分化方面表现较好。他们可以形成复杂的网络, 允许增强的细胞串扰, 这是一个重要的结果, 在3D 增长和区别。事实上, 结构调整可以创造出类似于那些细胞外基质蛋白的条件, 这是一个优势, 因为一个合理的研究所产生的影响每一个组成部分添加到脚手架 (生长因子, 多糖或信号肽) 可以很容易地进行。
与其他天然支架 (如胶原 i 型和胶) 相比, 使用该结构的明显优点如下: 1) 结构调整是一种合成生物材料, 从分批到分批生产的变化最小;2) 结构调整能力具有特定的肽图案功能;和 3) 结构在体外具有低生物降解性, 允许在一段时间内以相同的生物物理性、力学和结构特性维持3D 构造。然而, 在封装步骤中发现使用结构调整器与其他支架的限制, 因为 pH 值低, 细胞处于敌对的环境中。因此, 这是所述方法中的一个关键步骤。此外, 在开始任何实验之前, 确定每个特定细胞类型的 sap 浓度是很重要的。这实际上是必不可少的, 当细胞被培养或进入这些生物材料, 因为每一个特定的细胞类型将呈现最佳的生物力学生长条件。
最后, 我们相信, 设计和制造这种类型的生物材料脚手架将加强开发更多的生理和可靠的3D 组织模型, 以帮助制药业发展更好的治疗方法, 以再生医学, 癌症或任何医疗。
The authors have nothing to disclose.
作者所做的研究部分是由欧洲联盟第七框架方案 (FP7/2007-2013) 根据229239号赠款协议提供的赠款, 并由 AO 基金会、探索性研究合作研究项目急性软骨损伤/损伤/缺损 (CRP) 在项目生物活性和仿生支架的软骨再生 (BIOCART)。
Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |