Nous présentons ici un protocole afin d’obtenir des systèmes 3D-culture en auto-assemblage peptide échafaudages pour promouvoir la différenciation des chondrocytes articulaires humains dédifférenciées en tissu cartilagineux.
On décrit une technique utile pour la culture des cellules dans un échafaudage d’auto-assemblage nanofibres en trois dimensions (3D). Ce système de culture recrée un environnement qui imite étroitement les caractéristiques structurales des tissus non polarisé. En outre, la structure particulière de nanofibres intrinsèque de l’échafaudage rend transparent à la lumière visuelle, qui permet de faciliter la visualisation de l’échantillon en microscopie. Cet avantage a été utilisé pour étudier la migration cellulaire, organisation, prolifération et différenciation et ainsi toute évolution de leur fonction cellulaire par coloration avec des colorants spécifiques ou des sondes. En outre, dans ce travail, nous décrivons la bonne performance de ce système pour étudier facilement la redifférenciation des chondrocytes articulaires humains élargis dans le tissu cartilagineux. Cellules ont été encapsulés dans auto-assemblage peptide échafaudages et cultivées dans des conditions spécifiques pour promouvoir chondrogenèse. Cultures en trois dimensions a montré la bonne viabilité pendant les quatre semaines de l’expérience. Comme prévu, les échantillons cultivés avec des inducteurs de chondrogéniques (par rapport aux témoins non induite) teint fortement positifs pour le bleu de toluidine (dont les taches glycosaminoglycanes (GAG) qui sont très présents dans la matrice extracellulaire du cartilage) et a exprimé des marqueurs moléculaires spécifiques, y compris le collagène de type I, II et X, selon analyse Western Blot. Ce protocole est facile à réaliser et peut être utilisé dans les laboratoires de recherche, industries et dans les cours de laboratoire à des fins éducatives.
Pendant de nombreuses décennies, la culture de cellules de mammifères a été effectuée dans des conditions expérimentales utilisant des systèmes de la culture classique à deux dimensions (2D) en raison de problèmes pratiques et économiques, quels que soient les aspects non physiologiques. Même si ce système de culture permet d’étudier et de comprendre plus les mécanismes moléculaires et cellulaires, nous savons aujourd’hui que les nouveaux paradigmes de la culture de cellules sont nécessaires pour étudier les systèmes cellulaires plus complexes. Par conséquent, systèmes tridimensionnels (3D) sont nécessaires pour recréer un micro-environnement biophysiques, biomécanique et biologiquement plus semblable à celui des tissus naturels. Ces dernières années, les systèmes de culture 3D, en général, sont devenus plus répandues parmi les chercheurs et l’industrie parce qu’elles représentent un nouveau modèle d’étude ou de dépistage dans les cellules peuvent se développer dans l’espace, créer cellule-cellule ou interactions cellule-à-matrice, migrer et finalement la différence en lignées cellulaires spécifiques.
L’objectif global de cette méthodologie consiste à recréer un in vitro microenvironnement cellulaire qui s’en écarte le microenvironnement in vivo . En particulier, l’échafaud de peptide de l’auto-assemblage synthétique (SAPS) est un type de biomatériau ayant des propriétés uniques ; il forme un réseau des pores de taille nanométrique fabriqués à partir des interactions faibles entre les peptides aux propriétés mécaniques et structurales semblables celles des matrices extracellulaires naturelles. En d’autres termes, la rationalité derrière l’utilisation de ce matériau est qu’il crée un environnement 3D vraiment qui est idéal pour l’obtention de tissus de pseudo-3D ou des unités de l’orgue. Mais, surtout, le contexte 3D permet la structure 3D d’acquérir de nouvelles fonctions biologiques qui ne sont normalement pas présentes dans les plates-formes 2D de la culture, telles que les propriétés associées à l’architecture des tissus, des phénomènes de transfert de masse, structuration de cellules et, éventuellement, morphogenèse de tissus, qui sont des facteurs clés dans la recherche future et le développement des tissus fonctionnels et des organes1,2. En outre, un avantage des programmes d’ajustement structurel sur leurs homologues naturels (collagène, Matrigel) est qu’ils sont très stables à la température ambiante et ne nécessitent pas de conditions spéciales pour la post production, de distribution ou de stockage3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. programmes d’ajustement structurel est facile à manipuler, quand on le souhaite ; Gels 3D peuvent être obtenus simplement en augmentant la force ionique ou en ajustant le pH de neutralité1,2. Enfin, la méthode décrite ici a été largement utilisé in vitro pour promouvoir l’entretien, la croissance et la différenciation d’un certain nombre de types de cellules, y compris les chondrocytes, hépatocytes, cellules endothéliales, ostéoblastes, les cellules neuronales ainsi comme les cellules souches embryonnaires et somatiques3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. dans le présent travail, nous décrivons l’utilisation d’un système 3D-culture se différencier humains élargi des chondrocytes articulaires (hACh) en tissu cartilagineux comme décrit précédemment11.
Ici, on décrit une méthode de cellules en culture dans un système 3D à l’aide de programmes d’ajustement structurel. Dans ce biomatériau synthétique, les cellules sont mélangés au préalable avec une solution de peptide, qui est induite par la suite à s’auto-assembler, créant un réseau de dimensions nanométriques autour des cellules et créant ainsi un environnement véritablement 3D (Figure 1). Il est important de considérer que le comportement cellulaire est affectée par des valeurs de rigidité de matrice (c.-à-d., prolifération, migration et différenciation). Par conséquent, un contrôle méthodologique commun est aux cellules de culture sur le dessus de l’échafaud de peptide avec les mêmes valeurs de rigidité (culture sur deux dimensions).
Auparavant, notre groupe et autres ont décrit l’utilisation de plates-formes en trois dimensions (3D) culture avec cellule divers systèmes3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. Dans le présent travail, nous décrivons une méthode simple et fiable d’obtenir culture 3D systèmes qui s’appliquent à n’importe quel type de cellules de mammifères y compris n’importe quel type de cellule fonctionnelle, adulte ou embryonnaire de cellules souches, ou par la suite, les cellules dysfonctionnelles isolement de des biopsies ou des tumeurs et ainsi de suite. En outre, de manière indépendante, si les cellules souches sont d’origine embryonnaire ou adulte ils auraient une meilleure capacité d’engagement de lignée dans l’environnement 3D que dans la culture classique 2D plats10,11,12, 13,14,15. Par conséquent, la culture de cellules dans ce système conduirait à différenciation dans des structures ressemblant à des tissus fonctionnels pouvant servir dans des applications différentes, de biomédecine réparatrice ou régénératrice aux plates-formes toxicologiques et pharmacologiques.
Nous avons montré un gain évident en fonction de la cellule, car le microenvironnement cellulaire est semblable à celle des tissus naturels en ce qui concerne la structure de la matrice et les paramètres biomécaniques, biophysiques et biologiques. Néanmoins, que le système devient plus complex, le nombre de paramètres qui doivent être réglementés également des augmentations, qui comprend la nécessité d’une plate-forme de support externe (par exemple, un système de perfusion active pour éviter les problèmes associés aux phénomènes de transfert de masse ). En trois dimensions des cellules plus performants en termes de régulation des activités essentielles, telles que la différenciation, la prolifération et la migration. Ils pourraient constituer des réseaux complexes permettant la diaphonie cellulaire accrue, qui est de loin une conséquence essentielle de la croissance et la différenciation en 3D. Le fait que les sucs pourrait créer des conditions in vitro semblable à ces matrice extracellulaire protéines représente un avantage depuis une étude rationnelle de l’effet produit pour chaque composant ajouté à l’échafaud (facteur de croissance, polysaccharide ou signalisation peptide) pourrait facilement être menée.
Les avantages évidents de l’utilisation des programmes d’ajustement structurel par rapport aux autres échafaudages naturels, tels que le collagène de type I et Matrigel, sont les suivants : 1) programmes d’ajustement structurel est un biomatériau synthétique avec une variation minimale du lot de production par lots ; 2) programmes d’ajustement structurel a la capacité d’être fonctionnalisés avec des motifs de peptide spécifique ; et 3) présente des programmes d’ajustement structurel faible biodégradabilité in vitro, qui permet le maintien de la construction 3D avec les mêmes propriétés biophysiques, biomécaniques et structurelles au fil du temps. Toutefois, la limitation de l’utilisation de sucs par rapport aux autres échafaudages se trouve durant l’étape de l’encapsulation, où les cellules sont dans un milieu hostile en raison de la faible pH. C’est donc une étape cruciale dans la méthodologie décrite. En outre, il est important de définir la concentration des programmes d’ajustement structurel pour chaque type de cellule spécifique avant de commencer toute expérience. En fait, c’est essentiel lorsque les cellules sont cultivées sur ou dans ces biomatériaux, étant donné que chaque type de cellule en particulier présentera les conditions optimales de croissance biomécaniques.
Enfin, nous pensons que la conception et la fabrication de ce type d’échafaudage de biomatériau renforcerait l’élaboration de modèles de tissu 3D plus physiologique et plus fiable pour aider l’industrie pharmaceutique pour développer de meilleures approches thérapeutiques pour la médecine régénérative, cancer ou tout traitement médical.
The authors have nothing to disclose.
Les recherches effectuées par les auteurs a été soutenu en partie par des subventions de l’Union européenne septième Programme-cadre (7e PC/2007-2013) au titre de la subvention contrat no 229239 et de la Fondation AO, exploratoire Recherche Collaborative Research Programme aiguë Cartilage blessure/lésion/défaut (CRP ACI) dans le cadre du projet Bioactive et biomimétiques échafaudages pour la régénération du Cartilage (BIOCART).
Human articular chondrocytes (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
RAD16-I peptide solution (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
Sucrose (tissue culture grade) | Sigma | S0389 | |
Cell culture inserts (0.4 µm pore, 12 mm diameter) | Millipore | PICM01250 | |
Chondrocyte Basal Medium (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
SingleQuots of Growth Supplements | Lonza | CC-4409 | |
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
Dexamethasone | Sigma | D8893 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P) | Sigma | A8960 | |
Human transforming growth factor-β1 (TGF-β1) | Millipore | GF111 | |
RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Invitrogen | LC 2005 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
Anti-Actin | SCBT | sc-1615 | |
Anti-Collagen I | Abcam | ab138492 | |
Anti-Collagen II | Abcam | ab3092 | |
Anti-Collagen X | Abcam | ab182563 | |
Antigoat IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
Anti-mouse IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
Anti-rabbit IgG-HRP | Abcam | ab97051 |