Здесь мы представляем объективной количественной оценки конкретных участков белка ацетилирования и/или succinylation размещение (стехиометрии) всего протеома путем анализа ratiometric эндогенные изменения внесенные после количественных химические Ацилирование с использованием стабильных изотопов меченых ангидриды. В сочетании с приобретения чувствительных данных независимые масс-спектрометрии получены точные сайта размещение измерений.
Столб-поступательные изменения (ПТМ) белков остатков лизина,Ɛ– ацилирования N побуждает структурные изменения, которые могут динамически регулировать функций белков, например, путем изменения ферментативной активности или посреднических взаимодействий. Точное количественное определение конкретных участков белка Ацилирование размещение или стехиометрии, имеет важное значение для понимания функциональных последствий глобальной низкоуровневых стехиометрии и отдельных высокого уровня Ацилирование стехиометрии конкретных лизина остатков. Другие группы сообщили измерение лизин ацетилирования стехиометрии, сравнивая соотношение пептид прекурсоров изотопов от эндогенных, естественный изобилие ацилирования и экзогенные, тяжелые меченных изотопом Ацилирование представил после количественных Химическая ацетилирования белков с помощью стабильных изотопов меченых ангидрида уксусной кислоты. Этот протокол описывает оптимизированный подход, показывая несколько улучшений, в том числе: (1) повысили эффективность химического ацилирование, (2) возможность измерения протеина succinylation помимо ацетилирования и (3) улучшение количественных точности из-за сокращение помех с помощью фрагмент Ион Квантификация от приобретения данных независимые (DIA) вместо прекурсоров Ион сигнала от приобретения зависящих от данных (ДВР). Использование районов извлеченные пик от ионов фрагмент для количественной оценки также однозначно позволяет дифференциации уровня сайта Ацилирование стехиометрии из протеолитических пептиды, содержащие более одного остатков лизина, который не возможно с использованием прекурсоров Ион сигналы для количественной оценки. Визуализация данных в Skyline, открытым исходным кодом количественного протеомики среде, позволяет удобно данных проверки и рассмотрения. Вместе этот рабочий процесс предоставляет точной, беспристрастной и точной количественной оценки участкам лизин ацетилирования и succinylation размещение всего протеом, который может выявить и приоритеты Ацилирование биологически соответствующих сайтов.
NƐ– ацилирования белков остатков лизина является важным регулятором функции протеина. Ацетилирования лизина и других acylations, например succinylation, malonylation и glutarylation, как полагают, регулировать обмен веществ, клетки сигнализации и другие клеточные процессы1,2,3,4 , и имеют последствия в метаболических расстройств5. Многочисленные исследования показали, что ацильные модификации лизина проходят большие складки изменения в различных условиях в тканях млекопитающих и клеточной линии5,6,,78 , а также бактерии9,10,11, однако, эти изменения относительной раза не обеспечивают понимание доли общего белка изменения. Исследований, измерений заполненности сайт Ацилирование дефицитных12,13,14, несмотря на актуальность и потребность таких исследований, поскольку они обеспечивают более подробно, чем относительные раз отчетности изменения. Например десятикратного изменения может представлять увеличение размещение сайта от 0.01 до 0,1%, 1 до 10% или даже 10 до 100%. Точной стехиометрии измерения необходимо интерпретировать биологическое значение ацилирования и предсказать воздействие относительно масштабов протеина структурного и, возможно, функциональные изменения.
Один из предыдущих методов для количественного определения сайта размещение использует тяжелые стабильного изотопа химического маркировки остатков неизмененном лизин, следуют масс-спектрометрии для измерения соотношения между эндогенного «легкие» ацетилирования по сравнению с внешними, химически-с надписью «тяжелых» ацетил лизин с использованием прекурсоров Ион интенсивности12. Другое недавнее исследование, проведенное Чжоу и др. 13 описал аналогичный подход к оценке стехиометрии ацетилирования лизин, которая также занятых полный химический ацетилирования всех остатков неизмененном лизина в белках с стабильного изотопа маркировки, но используется фрагмент Ион интенсивности как измеряется ДВР. Nakayasu и др. 14 используется аналогичный подход ДВР, но вместо этого используется соотношение легких и тяжелых ацетил лизин immonium ионов для количественной оценки. Количественной оценки, основанные на фрагмент ионов, immonium или последовательность ионов (МС2), в большинстве случаев приводит к менее сигнал помех по сравнению с обработкой нетронутыми пептид прекурсоров ионов (MS1). Однако количественного определения ионов фрагмент из ДВР генерируемые МС/МС спектры может страдать от стохастической выборки недостатки, где ионы высокой изобилие прекурсоров чаще выбираться для МС/МС и таким образом, привести к неполной и предвзятой выборки прекурсоров ионов.
Этот роман рабочего процесса4 (рис. 1) использует концептуально стабильного изотопа химического маркировки подход, первоначально разработанный Baeza и др. 12, однако рабочий процесс впоследствии наряду с DIA для сбора обоих прекурсоров и несколько обилия Ион фрагмент над обнаружению массы в диапазоне15,16 обеспечение точной стехиометрии расчеты.
Пик областях от фрагментации ионов, содержащие ацилирования сайта интересов, или «дифференциации фрагмент ионов», используются для количественного определения Ацилирование сайта размещение (Рисунок 2). Фрагмент ионов, которые не содержат изменения имеют идентичные легких и тяжелых m/z значения и используются для идентификации пептид, но не для количественной оценки. Скайлайн программного обеспечения17 используется для извлечения прекурсоров и фрагмент пик районах. Наличие нескольких фрагментов ионов, содержащие ацилирования данного сайта обеспечивает гибкость при обнаружении помех в некоторых ионов фрагмента. Визуализация данных в Skyline позволяет проверки критических соотношений фрагмент легких до тяжелых ионов. Помимо анализа данных вручную был разработан пакет R открытым исходным кодом, написанные самостоятельно, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), которая использует прекурсоров Ион и фрагмент Ион собранные данные через DIA и количественно стехиометрия участкам Ацилирование из пептидов, содержащих несколько остатков лизина, функция не представляется возможным с прекурсорами Ион только интенсивность измерения4.
Этот протокол также демонстрирует использование endoproteinase Glu-C, который является специфичным для расщепления C-терминала на остатков глутаминовой и аспарагиновой кислоты, вместо трипсина или Arg-C протеазы, как последний часто генерировать очень большие и потенциально умножить Ацилированного протеолитических пептиды, вытекающие из заблокированных трипсина расщепление на ацилированных остатков лизина. Химическая, маркировки процедура распространяется также на включают пользование янтарной ангидрид (рис. 1), что позволило количественная оценка succinylation стехиометрии succinylation. Помимо улучшения подготовки пробы, осуществление фракционирование пептида в автономном режиме, основные рН, вспять фазы (bRP) разделение пептидов далее сократилась количественную оценку вмешательств, позволяя лучше де свертки Ацилирование стехиометрии в целом протеома образцов. Вместе, этот метод имеет и выделяет ряд преимуществ: (1) повышение эффективности химической Ацилирование; (2) Измерение белка succinylation стехиометрии помимо ацетилирования; и (3) совершенствование количественной оценки точности. Улучшение количественной объясняется снижение помех в фрагмент Ион сигналы от Диа, по сравнению с ДВР прекурсоров сигнала, а также осуществление off-line пептид предварительно фракционирование bRP.
Этот протокол обеспечивает Роман и точный метод для количественной оценки конкретных лизин ацетилирования и размещение succinylation, который может быть применен для всего протеома. Этот метод полагается на измерение внутреннего света пептидов и экзогенные тяжелых пептиды, последний из которых являются созданные в пробирке с использованием количественного химического Ацилирование белков с транс уксусный ангидрид –d6 или янтарной ангидрид –d4 (рис. 1). Подобные методы стабильных изотопов маркировки родной неизмененном лизин остатков и исполнена количественной размещение сайта на основе либо прекурсоров Ион только12 или фрагмент ионов из ДВР приобретений13,14. Этот протокол применяется несколько шагов во время подготовки проб для повышения эффективности ацилирования и расширяет химических маркировки для succinylation. Сбора данных с использованием DIA приобретений получает Ион прекурсоров и MS2 фрагмент Ион интенсивности по всему диапазону обнаружению массовых, тем самым уменьшая фрагмент ионных взаимодействий. Анализ и количественная оценка через Skyline и пользовательские скрипты, собственной разработки позволяют рассчитать размещение сайта для пептидов, содержащие более одного остатков лизина и более чем одной Ацилирование на одном сайте.
Существует несколько важных шагов на этапе подготовки образца этот протокол, который должен быть внимательно следил. Поскольку весь протокол опирается на эффективный химической модификации всех остатков лизина, этот шаг имеет первостепенное значение. Ангидриды реагируют с бесплатные амины, поэтому следует избегать Амин содержащие буфер или загрязняющими молекул в lysate белка. Также во время шага химического ацилирование, убедитесь, что рН реакционной смеси является обратно к рН 8 после каждого из трех инкубаций с реактивом ангидрида как эта реакция подкисляет смесь, и O-ацилирования побочные реакции могут образовывать. Кроме того разбавление 8 M мочевины содержащих реакция смеси около 0,8 М мочевины до пищеварение и проверка, что pH в пределах оптимального диапазона имеет важное значение для оптимальной деятельности endoproteinase Glu-C. Еще одним ключевым компонентом нашей протокола является шагом сбора данных и введение DIA рабочего процесса, который преодолевает любые несоответствия данных выборки ДВР и который позволяет для количественной оценки на уровне Ион фрагмент MS2. Одно главное преимущество DIA методологии является снижение помех, которые, как правило, гораздо более проблематичным и ошибкам при количественной оценке MS1 прекурсоров Ион сигнал (как предлагали некоторые из предыдущих изданий).
Несколько изменения рабочего процесса могут быть сделаны при подготовке весьма сложные образцы. Количество фракций в пул после того, как автономный фракционирование ВЭЖХ обратная фаза basic рН может быть уменьшена снизить сложность объединения образцов, которые будут приобретаться по LC/жа Кроме того, больше хроматографического градиенты могут также быть использованы во время приобретение для лучшего разделения пептид. В качестве альтернативы может использоваться несколько протеаз переваривать образцов производят большее разнообразие рассеченного пептидов и увеличить охват белков остатков лизина. Суд работает и оптимизации может проводиться с использованием коммерческих BSA, содержащие конкретные процентные ацетилирования или succinylation.
Одно ограничение к настоящему протоколу является потенциально небольшой сайт размещение переоценки из-за пропавших без вести другие модификации лизина, например метилирования или ubiquitination и т. д.на том же сайте4. Рассчитано из области пик легких и тяжелых ацил модификаций, L/(L+H), размещение сайта основывается на предположении, что общий уровень изменения на сайте лизин состоит из только эндогенного «свет» Ацилирование (L) и химически помечены «тяжелый» Ацилирование (H). Однако фактическое общее Ацилирование размещение на сайте в естественных условиях может включать в себя другие модификации после ацетилирования и/или succinylation. Кроме того, сообщил изотопный чистоту приобретенных реагентов уксусный ангидрид –d6 (99%) и янтарной ангидрид –d4 (> 98%) может способствовать небольшое преувеличение до 2% (succinyl) или 1% (ацетил) эндогенные Ацилирование уровня4. Вместе, эти небольшие переоценки добавить трудность количественного определения сайтов с менее чем 1% размещение. Большое изобилие различия между полным химически ацилированных пептидов и родной ацилированных пептиды также способствуют потенциальные ошибки квантификации размещение сайта, особенно для низкого эндогенного ацилированных пептиды27. Недавнее исследование, проведенное Weinert и др. 27 обнаружили, что снижение обилия различия между полным за ацетилированные пептидов может уменьшить ошибки количественная оценка27.
Стехиометрия количественной, собранной с помощью этого протокола может определить важные Ацилирование горячих точек в частности белка и формы гипотезы для биологических последующих экспериментов, таких как сайт Направленный мутагенез определенных мест, представляющих интерес. Этот протокол также может выявить комбинированные эффекты низкой Ацилирование стехиометрии сайтов, которые могли бы оказать косвенные или тонкие влияния на структурную стабильность белков и локализованные клеточной среды. Кроме того осуществление этого протокола для измерения ацетилирования и succinylation и другие возможные лизин Ацилирование модификации после ацетилирования будет уникально предлагают взглянуть на динамических Ацилирование воздействия на белки при различных биологических условий.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана NIH национального института диабета и пищеварения и болезни почек NIH-NIDDK Грант R24 DK085610 (PI: E. Verdin). JGM была поддержана NIH T32 стипендий (T32 AG000266, Пи: J. Campisi). Авторы признают, что поддержка от НИЗ совместно инструментария Грант для системы TripleTOF 6600 в институте бак (1S10 OD016281, Пи: B.W. Gibson).
aqueous acetic anhydride-d6 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 175641-1G | 1% isotopic purity |
succinic anhydride-d4 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 293741 | 2% isotopic purity |
sequencing grade endoproteinase Glu-C | Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma) | 10791156001 | 1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt) |
Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT 094225 | |
HPLC acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH015-4 | |
HPLC grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJAH365-4 | |
iodoacetamide | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
FLUKA formic acid (FA) for mass spec | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA | C988C27 | ~98% |
urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
bovine serum albumin (BSA) | Pierce, Rockford, IL, USA | 88341 | |
triethylammonium bicarbonate (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408-100ML | |
anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO) | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | 43998 | |
sodium hydroxide (NaOH) | EMDMillipore, Burlington, MA, USA | SX0590 | |
50% hydroxylamine solution in water | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | 438227-50ML | |
LC-MS grade water | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC365-4 | |
LC-MS acetonitrile | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC015-4 | |
Eppendorf Themomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | |
Waters 1525 binary HPLC pump system | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters 2487 Dual Wavelength UV detector | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT081110 | |
Waters 717plus Autosampler | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT022939 | |
Waters Fraction Collector III | Waters Corp., Milford, MA, USA | 186001878 | |
Agilent Zorbax 300Extend C18 column | Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA | 770995-902 | |
Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer | Labconco, Kansas City MO, USA | 7751000 | |
indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | model# 845 | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | per quote | |
C18 pre-column chip (200 μm × 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 μm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00006 | |
SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2 | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | software download Sciex | |
Spectronaut | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | Sciex LLC, Framingham, MA, USA | 804-00001 |