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Bioquímica

Chemoreceptor Ligand बाइंडिंग डोमेन के कुशल रिसामने और शुद्धिकरण के लिए विधि

Published: December 12, 2017
doi:
10.3791/57092
,
1Infection and Immunity Program,Monash Biomedicine Discovery Institute, 2Department of Microbiology,Monash University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology,Monash University

Summary

एक प्रक्रिया को शामिल निकायों से dCACHE periplasmic ligand बंधन डोमेन के कैम्पिलोबैक्टर jejuni chemoreceptor Tlp3 का खुलासा करने के लिए प्रस्तुत किया है और शुद्धि के लिए प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा उपज ।

Abstract

ligand विशिष्टता के आणविक आधार के elucidation के उद्देश्य से chemoreceptors और संरचनात्मक अध्ययन के प्राकृतिक लाइगैंडों की पहचान, शुद्ध, जोड़ मिलीग्राम बाइंडिंग डोमेन के ligand मात्रा के उत्पादन के द्वारा काफी सुविधा हो सकती है । ई कोलाई (ई. कोलाई) में बैक्टीरियल chemoreceptors की एक्सप्रेस periplasmic ligand बंधन डोमेन heterologously करने के लिए प्रयास अक्सर शामिल निकायों में अपने लक्ष्यीकरण में परिणाम । यहां, एक विधि शामिल निकायों से प्रोटीन वसूली के लिए प्रस्तुत किया जाता है, इसका खुलासा और शुद्धि, periplasmic dCACHE ligand बाइंडिंग डोमेन का उपयोग कर कैम्पिलोबैक्टर jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 एक उदाहरण के रूप में । दृष्टिकोण एक सट अपने6टैग, अलगाव और यूरिया के साथ ब्याज के प्रोटीन की अभिव्यक्ति शामिल निकायों के मध्यस्थता solubilisation, यूरिया कमी के द्वारा पुनः प्रकट प्रोटीन, और समानता के माध्यम से शुद्धि क्रोमैटोग्राफी, टैग हटाने और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा पीछा किया । परिपत्र dichroism स्पेक्ट्रोस्कोपी शुद्ध प्रोटीन की तह राज्य की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यह प्रदर्शित किया गया है कि इस प्रोटोकॉल आम तौर पर एक घुलनशील और chemoreceptors रूप में अंय जीवाणु crystallisable के dCACHE periplasmic ligand बाध्यकारी डोमेन के मिलीग्राम मात्रा के उत्पादन के लिए उपयोगी है ।

Introduction

Chemotaxis और गतिशीलता को होस्ट1,2,3के बैक्टीरियल रोगजनन और आक्रमण को बढ़ावा देकर कैम्पिलोबैक्टर jejuni colonisation में महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाते दिखाया गया है । Chemotaxis बैक्टीरिया विकास के लिए एक इष्टतम वातावरण की ओर जाने के लिए अनुमति देता है, के रूप में रासायनिक संकेतों द्वारा निर्देशित । इस प्रक्रिया में प्रोटीन का एक सेट chemoreceptors, या transducer की तरह प्रोटीन (Tlps) के द्वारा intracellular और पर्यावरणीय रासायनिक संकेतों की मांयता शामिल है । अधिकांश chemoreceptors एक extracytoplasmic ligand बाइंडिंग डोमेन (LBD), एक transmembrane डोमेन और एक cytoplasmic संकेत डोमेन के साथ झिल्ली-एंबेडेड प्रोटीन होते हैं, जिसके बाद संकेत संचारित करने वाले cytosolic संकेत प्रोटीन के साथ इंटरैक्ट करता है को flagellar मोटर्स4,5,6,7।

ग्यारह विभिन्न chemoreceptors की पहचान सी. jejuni जीनोम4,8में की गई है । तारीख करने के लिए, इन chemoreceptors के केवल कुछ विशेषता है और Tlp1 के ligand विशिष्टता9, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712, और Tlp1113 है जाना जाता है । इस प्रजाति में शेष chemoreceptors के प्राकृतिक लाइगैंडों की पहचान, और अन्य जीवाणुओं में कई chemoreceptors, तह और अत्यधिक शुद्ध रिकॉमबिनेंट chemoreceptor LBDs14के उत्पादन द्वारा बहुत सुविधा हो सकती है, 15 , 16. हालांकि, heterologously एक्सप्रेस periplasmic LBDs में बैक्टीरियल chemoreceptors के प्रयास ई कोलाई में अक्सर परिणाम को शामिल करने के निकायों में उनके लक्ष्यीकरण में17,18,19 . फिर भी, इस घटना आसान अलगाव और हाथ में प्रोटीन की वसूली की सुविधा कर सकते हैं । यहां, एक विधि शामिल निकायों से प्रोटीन वसूली के लिए प्रस्तुत किया है, इसका खुलासा और शुद्धि, एक उदाहरण के रूप में ग. jejuni chemoreceptor Tlp3 के periplasmic LBD का उपयोग कर । इस उदाहरण चुना गया था क्योंकि Tlp3-LBD संवेदन डोमेन के dCACHE परिवार20 के अंतर्गत आता है जो बहुतायत से दो घटक histidine kinases और chemoreceptors में prokaryotes20,21में पाया जाता है, 22 , 23.

इस दृष्टिकोण में, अभिव्यक्ति का निर्माण, एक pET151/D-टोपो वेक्टर के आधार पर, एक N-टर्मिनल को शामिल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है6-एक तंबाकू खोदना वायरस (टेव) के बाद टैग को छेड़ो दरार साइट, बाद में टैग हटाने के लिए19। प्रोटोकॉल ई. कोलाई, अलगाव और यूरिया-शामिल किए जाने वाले निकायों के मध्यस्थता solubilisation में प्रोटीन की कमी का वर्णन है, और प्रोटीन यूरिया घट द्वारा पुनः प्रकट । बाद में, नमूना अपनत्व क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध है, वैकल्पिक टैग को हटाने और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के साथ । शुद्ध प्रोटीन की तह राज्य परिपत्र dichroism स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर पुष्टि की है । इस विधि का एक संशोधित संस्करण है कि पहले से ठीक है और एक अलग chemoreceptor, Helicobacter हेलिकोबेक्टर TlpC19के LBD शुद्ध विकसित किया गया है । यह प्रक्रिया, चित्रा 1में संक्षिप्त, पैदावार 10-20 शुद्ध, untagged Tlp3-LBD प्रति 1 बैक्टीरियल संस्कृति के एल, के एक प्रोटीन शुद्धता के साथ > 90% के रूप में एसडीएस द्वारा अनुमानित-पृष्ठ ।

Protocol

1. ई. कोलाई में अपने6-Tlp3-LBD की अभिव्यक्ति Inoculate १५० मिलीलीटर बाँझ Luria-Bertani (LB) शोरबा युक्त ५० µ g mL-1 एम्पीसिलीन with BL21-Codon-Plus (DE3)-RIPL कोशिकाओं pET151/डी-टोपो वेक्टर अपने6-Tlp3-LBD (एमिनो एसिड अवशेषों 42-291) की अभिव्यक्त?…

Representative Results

ई. कोलाई में अपने6-Tlp3-LBD के रिकॉमबिनेंट अभिव्यक्ति शामिल निकायों में प्रोटीन जमाव के परिणामस्वरूप । 1 एल से अभिव्यक्ति की उपज बैक्टीरियल संस्कृति के चरण २.१३ में गणना की लगभग १०० मिलीग…

Discussion

अभिव्यक्ति के लिए एक सरल प्रक्रिया और बैक्टीरियल chemoreceptor Tlp3 के periplasmic LBD के शामिल निकायों से गुना प्रस्तुत किया है । शुद्ध प्रोटीन की तैयारी से अधिक की अभिव्यक्ति शामिल है पीईटी-प्लाज्मिड-एनकोडेड जीन में ई….

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम Tlp3-LBD उत्पादन पर अपने शुरुआती काम के लिए यू सी लियू धंयवाद । मायरा ए. Machuca डॉक्टरी छात्रवृत्ति के लिए Departamento Admistrativo डे Ciencia, Tecnología ई Innovación COLCIENCIAS का ऋणी है ।

Materials

Tris base AMRESCO 497
Sodium chloride (NaCl) MERK MILLIPORE 1064041000
Ampicillin G-BIOSCIENCES A051-B
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)  MERCK 52332
Triton x-100 AMRESCO 694
Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD AST0487
Urea AMRESCO VWRC0568
Dithiothreitol ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD C-1029
L-arginine monohydrochloride SIGMA-ALDRICH A5131
Reduced L-glutathione SIGMA-ALDRICH G4251
Oxidized L-glutathione SIGMA-ALDRICH G4376
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) SIGMA-ALDRICH  7558-79-4
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) SIGMA-ALDRICH 10049-21-5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) AMRESCO VWRC20302.260
Imidazole SIGMA-ALDRICH I2399
Glycerol ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD BIOGB0232
Nickel chloride (NiCl2) SIGMA-ALDRICH 339350
Glycine AMRESCO VWRC0167
Sodium dodecyl sulfate (SDS) SIGMA-ALDRICH L4509
Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) NEW ENGLAND BIOLABS P7703
Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) MERCK UFC901096
50 mL Falcon tube FALCON BDAA352070
Dialysis tubing LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY Dialysis
Snakeskin dialysis tubing THERMO SCIENTIFIC™ 68100
Prepacked HiTrap Chelating HP column GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 17-0408-01 
EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser AVESTIN EmulsiFlex™ – C5
Peristaltic Pump P-1 GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 18-1110-91 
Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column  GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 28989336
JASCO J-815 spectropolarimeter JASCO J-815
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Machuca, M. A., Roujeinikova, A. Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain. J. Vis. Exp. (130), e57092, doi:10.3791/57092 (2017).
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