Summary

Фракционирование резолюции растворимых и нерастворимых гентингтина видов

Published: February 27, 2018
doi:

Summary

Для фракционирования растворимых и нерастворимых мутант гентингтина видов от мыши мозга и клетки культуры описан метод. Метод, описанный полезен для характеристик и количественной оценки потока белок гентингтин и СПИДа в анализе белка гомеостаза в патогенезе заболевания и при наличии возмущений

Abstract

Накопление смятых протеинов имеет центральное значение для патологии в болезни Гентингтона (HD) и многих других нейродегенеративных расстройств. В частности ключевой особенностью патологических HD это ненормальное накопление Мутантный белок HTT (mHTT) в высокой молекулярной массой комплексов и внутриклеточные включения органы, состоящие из фрагментов и других белков. Традиционные методы измерения и понять, что вклад различных форм mHTT содержащих агрегаты включают микроскопии флуоресцирования, Западный анализ помаркой и фильтра улавливания анализов.

Однако большинство из этих методов являются конформации конкретным и поэтому не может разрешить полное состояние потока белка mHTT из-за сложного характера агрегатные растворимость и резолюции.

Для определения совокупных mHTT и различных модифицированных форм и комплексов разделения и солюбилизация клеточных агрегатов и фрагменты является обязательным. Здесь мы описываем метод, чтобы изолировать и визуализировать растворимых mHTT, мономеры, олигомеры, фрагменты, и нерастворимые высокомолекулярные (HMW) накопленных mHTT видов. HMW mHTT треки с прогрессирования заболевания, соответствует мыши поведения отсчетов и было выгодно модулированные некоторых терапевтических вмешательств1. Этот подход может использоваться с мыши мозга, периферических тканях и культуру клеток, но могут быть адаптированы к другие модели систем или болезни контекстах.

Introduction

Разрушение белка контроля качества сетей, которые обеспечивают надлежащего складные и деградации клеточных белков — вероятно, центральное место в патологии в болезни Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Гентингтона (HD) и другие «сворачиванию белков» расстройства,2,3. Глубокое понимание proteostasis сетевые компоненты и их вклад в патологии Поэтому решающее значение для разработки более терапевтических вмешательств. HD это вызвано ненормальное расширение CAG повторять в течение HD гена, что приводит к расширенный участок polyglutamines (polyQ) в белок гентингтин (НТТ)4. Последовательное патологических особенностью патогенеза HD является полученный сворачиванию, накопление и агрегирования HTT в регионах мозга и периферических тканях, который был показан несколькими способами мешать нормальной клетки гомеостаза и функции 5 , 6. Хотя HTT повсеместно выражается, средний колючий нейронов в стриатума выборочно уязвимых и наиболее открыто пострадавших с заметных корковой атрофии, также связанные с HD патогенеза.

Формирование агрегатов HTT в мозге животных моделей и HD пациентов обычно служил прокси маркера для прогрессирования заболевания и Доминант отрицательный прирост функции для mHTT7. Хотя конкретные механизмы, которые белка сворачиванию и агрегирование может способствовать mHTT индуцированной токсичности остаются неясными, инвариантная и неизбежной особенностью является формирование этих включений в мозге пациентов HD и различных животных моделей. Включений появляются состоять главным образом из накопленных HTT фрагменты, содержащие N-терминальный расширил polyQ, указывающее, что Протеолиз и обработку полноразмерных HTT, а также альтернативного сплайсинга8,9 может играть важную роль в патогенезе HD. N-терминальный HTT фрагментов могут представлять собой патологические формы HTT, который может быстро объединять, nucleate и ускорить или распространять процесс агрегации10.

Однако присутствие этих включений не обязательно коррелирует с НТТ индуцированной токсичности или клеток смерть11. HTT было предложено пройти процесс агрегации из растворимых мономера через растворимых олигомерных видов и β-лист фибриллами нерастворимых агрегатов и включений12. Урегулирование этих различных видов белков через стандартный биохимических анализов был вызов в области из-за их стабильность, низкая-моющее средство литического буфера и сложности в визуализации с помощью стандартных биохимических анализов. Таким образом методологические соображения имеют решающее значение в выявлении степени и шаблон накопленные и агрегированных mHTT.

Протокол, представленные здесь предоставляет метод для визуализации несколько промежуточных HTT, специально образование нерастворимых HMW HTT видов, который появляется внимательно отслеживать с HD патогенеза и болезнь прогрессии1,13 ,14. Будучи в состоянии решить и отслеживать несколько видов mHTT обеспечивает исследователей биохимических инструмент для изучения патогенеза заболевания и оценки потенциальных терапевтических вмешательств через их модуляции и влияние на патогенез болезни.

Protocol

-Животных этики заявление эксперименты проводились в строгом соответствии с руководством для ухода и использования лабораторных животных протокола институциональный уход животных и использование Комитета (утвержденных исследований на животных и национальных институтов здравоохра…

Representative Results

Резолюция растворимых и нерастворимых lysates клетки после фракционирование могут быть обнаружены с помощью западных анализа и фильтрации отсталости анализов (рис. 2). Например, HEK293T клетки были transfected с помощью трансфекции реагента (например, lipofectamine …

Discussion

Некоторые меры предосторожности необходимы для вышеуказанных протоколов для обеспечения последовательного и количественных результатов. Во-первых, mHTT в обеих фракций спонтанно образуют агрегаты со временем на несколько циклов замораживания-оттаивания, особенно когда в высокой конц…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана NIH (RO1-NS090390). Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Джоан Steffanfor технической помощи и обсуждения в ходе разработки этот assay.

Materials

Sterile Filter Millipore SCGP505RE Screw cap, sterile vaccum filter
1 mL Tissue Grinder, Dounce Wheaton 357538
Sonicator Qsonica Model Q125
DC Protein Assay Biorad 5000111 Comparable to Lowry assay
Tris 1M buffer solution Alfa Aesar J60636
Triton X-100 Fisher BP151-100
NaCl 5M solution Teknova S0251
Glycerol Fisher BP229-1
20% SDS solution Teknova S0295
N-ethylmaleimide Sigma E1271
Phenylmethylsulfony flouride Sigma P7626 create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C
Sodium orthovanadate Sigma S6508 Create 0.5M stock solution in water
Leupeptin Sigma L2884 Create 10mg/ml stock solution in water
Aprotinin Sigma A1153 Create 10mg/ml stock solution in water
Sodium Fluoride Sigma S4504 Create 500mM stock solution in water
Anti-HTT Millipore MAB5492 Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay
Anti-GAPDH Novus Biologicals NB100-56875 Use 1:1000 for soluble western blot

Referências

  1. Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington’s Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
  2. La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
  3. Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington’s disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
  4. The Huntington’s Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington’s disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  5. Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington’s disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
  6. Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington’s disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington’s disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
  7. Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington’s Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
  8. Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington’s disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
  9. Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington’s disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).
  10. Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington’s disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
  11. Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
  12. Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington’s Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
  13. O’Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
  14. Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
  15. Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
  16. Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
  17. Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
  18. Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
  19. Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington’s disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
  20. Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73 (2009).
  21. Shahmoradian, S. H., et al. TRiC’s tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710 (2013).
  22. Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
  23. Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).

Play Video

Citar este artigo
Ochaba, J., Morozko, E. L., O’Rourke, J. G., Thompson, L. M. Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species. J. Vis. Exp. (132), e57082, doi:10.3791/57082 (2018).

View Video