להמחיש ליקוציט מתגלגל והצמדות אנגיוטנסין II חדורים עכברים: טכניקות ואת החסרונות

הניסויים נערכו על עכברים זכר גיל 8 עד 12 שבועות תחת האישור של ועדת האתיקה על ניסויים בבעלי חיים של ריינלנד-פאלץ (אישור מספר 23 177-07/G12-1-002 ו 23 177-07/G15-1-051). 1. עכבר הכנה ניתוח והרדמה לפני הניתוח, לוודא את בריאות טובה ואת מצבם של בעלי החיים. לפני הניתוח, לפקח על בעלי חיים פעם אחת ביום למשך 2-3 ימים על מצבם הכללי (מראה, תנוחות, התנהגות ספונטנית) כמו גם משקל הגוף, המזון וצריכת מים. להכין את תערובת הבסיס עבור הרדמה עם midazolam (5 מ”ג/ק”ג משקל גוף), medetomidine (0.5 מ”ג/ק”ג משקל גוף) של פנטניל (0.05 מ”ג/ק”ג משקל גוף) intraperitoneally (i.p.) להזריק 200 העכבר µL/30 גרם ב 1 מ”ל מזרק עם מחט 26 גרם. משאבת osmotic השרשה והכנת בעלי חיים לניסויים IVM מבוצעות על שדה הפעולה ב- C ° 39 ההתחממות פלטפורמה. לחטא את כל הכלים באמבט חיטוי ולחטא את הפלטפורמה התחממות כדור הארץ. במהלך ההליכים, להגן על העיניים בעלי חיים עם משחה העין. הסר את הפרווה עם סכיני גילוח לפני המשאבה osmotic השרשה. השתמש להסרת שיער קרם ספוגיות כותנה עבור בידוד של לעורק הראש, צוואר קטטר השרשה בניסויים IVM. לחיטוי עור החיה באמצעות שני אמצעי חיטוי העור: אחד מחטא וקוטל המכיל povidone יוד ואחד העור מחטא המכיל octenidine בפתרון מבוסס-אלכוהול. להכין את תערובת הבסיס להרגיז את ההרדמה (“מיקס antisedan”) עם atipamezol (0.05 מ”ג/ק”ג משקל גוף), פלומאזניל (0.01 מ”ג/kgbody משקל), ולהכין µL 200/עכבר במזרק 1 מ”ל עם מחט 26 גרם להיות subcutaneously (ש) מוזרק. 2. osmotic משאבת והכנה השרשה הערה: עירוי תת-עורי AngII באמצעות משאבות osmotic תוארה בפירוט על ידי Lu. et al. 17 להכין את AngII על-ידי לשחזר את האבקה lyophilized עם סליין סטרילי ולהתאים את הריכוז עם המשקל בעלי חיים ואת קצב משלוח של המשאבה. שמור את AngII משוקם צינורות פלסטיק (אל תשתמש צינורות זכוכית). למלא את המשאבות הפתרון AngII כדי לספק 1 mg/(kg·d) במשך 7 ימים. לאחר ההכנה, לשמור את המשאבות מלח סטרילית עבור 4-6 שעות מינימום ב 37 º C. הבדיקה בהרדמה מלאה של העכבר לאחר הזרקה של המיקס הרדמה עם אחורי רגל רפלקסים ומניחים אותו על המגרש מבצע חם. הרדמה אינדוקציה לוקח 10-15 דקות, עובד טוב יותר אם חיות ממוקמים בסביבה חשוכה. לגלח את הגב התחתון העכבר ולחטא אותו עם חיטוי אלכוהולי העור. עושים חתך 1 ס מ בניצב לעמוד השדרה באמצעות מספריים. ליצור כיס עבור המשאבה באמצעות עוצר דימום מצר ולהוסיף את המשאבה (זרימה מנחה קודם). הכיס לאפשר תנועה חופשית של המשאבה עם אין לחץ על הפצע. לסגור את הפצע עם התפרים, לא קליפים, על מנת להגביל את דלקת; לאחר מכן לחטא עם חיטוי העור. הקטנטנים של ההרדמה בזריקה ספורטינג של 200 µL של המיקס antisedan וחוזרים העכבר בכלוב. לבצע נגד כאבים לאחר הניתוח עם הבופרנורפין (0.075 ק מ”ג/ק”ג ספורטינג) פעם אחת לאחר הניתוח, על פי דרישה בהתאם להתנהגות בעלי חיים. 3. צוואר קטטר השרשה והכנות לעורק הראש הבדיקה בהרדמה מלאה של העכבר לאחר הזרקה של ההרדמה לערבב עם מזון אחורי רפלקסים, למקם את החיה anesthetized recumbence הגבי בצלחת כירורגי 39 ° C עם מכשיר בדיקה רקטלית על מנת לשמור על הטמפרטורה, לשים את המשחה על העיניים כדי להגן עליהם במהלך ההליך. להסיר שערות הצוואר השימוש בקרם להסרת שיער. השתמש ספוגית כותנה כדי להפיץ ומרח את הקרם למשך 2 דקות עד שהשערות מתחיל לנשור. לאחר 2 דקות נוספות, להסיר את קרם ואת שערות עם מרית, לחטא את העור עם העור אלכוהוליים חיטוי. לבצע את הניתוח תחת stereomicroscope. עושים חתך ארוך 1 – 1.5 ס”מ בעור longitudinally בצוואר, 1 ס מ ליד קנה הנשימה. ואז להפוך אחרים שני חתכים בניצב כדי בשני הגפיים החתכים הראשונים. בזהירות להסיר רקמות לצד העור ולהסיר את פיסת העור כיסוי ומוחלף השמאלי על קנה הנשימה. בזהירות לבודד את בלוטת הפרוטיד; בלוטות sublingual, submaxillary מאזור עניין עם מלקחיים מעוקל 2. לא לחתוך או נזק הבלוטות, למקם אותם כדי לאפשר את הגישה הטובה ביותר ומוחלף על וכדי לעורק הראש. כדי לבודד את ומוחלף, להשתמש מלקחיים דק לאט ולפתוח ולסגור אותו לשחרר בעדינות את הכלי מן הרקמה שמסביב. פעם אחת הווריד נקייה לגמרי, מקם את המלקחיים תחת הכלי ומניחים התפרים 7-0 שני של 10 ס מ כל אחד מתחת. סגור את התפר מקורב לראש עם שני קשרים. התפר אחרים, להכין קשר אחד אך אינו סגור. . תחזיק את הקטטר (0.28 מ מ בתוך הקוטר החיצוני 0.61 מ מ, קוטר) מלא מלח סטרילית 37 ° C עם מלקחיים עם יד אחת; בזמן עם היד השנייה, עושים חתך קטן לתוך הכלי עם מספריים דק או מחט 26 גרם מעוקל. לאחר מכן להכניס את הצנתר ומוחלף על, וסגרי את הקשר פעמיים. סגור את התפר מקורב לראש על הצנתר על מנת להבטיח הנייח מלאה. כדי לבודד ולהכין בעורקים, לנתח המשתרע על קנה הנשימה באמצעות מלקחיים מעוקל דק. לאחר לעורק הראש חינם מן הרקמות הסובבות, להסיר את העצב התועה (זה נראה כמו פס לבן צמוד בעורק) מכלי הקיבול (אבל זה לא מספיק). המלקחיים דק יכול להיות סגור ופתח לאט לגייס בעדינות את העצב. לאחר שני העורקים נקיים לגמרי, מקום המלקחיים תחת העורק הראשי הראשון ולמקם קטן שחור 3 מ מ רוחב x 2.5 ס מ אורך פלסטיק חתיכה תחת הכלי. חשוב מאוד לא overstretch את הכלי, כדי לבדוק זרימת הדם נוכחת ברגע בעל כלי השיט ממוקם. מקם את העורק השני מעל בעל כלי השיט. אם העכבר אינם ממוקמים ישירות מתחת למיקרוסקופ, תחזיר את הבלוטות מעל קנה הנשימה ולהחיל מלח סטרילית 37 ° C כדי למנוע ייבוש של האזור. 4. הערכה של גלגול והקפדה לויקוציטים / LysM + תאים עם IVM להכין acridine כתום פתרון מניות 2 מ”ג/מ”ל המאוחסנים ב-20 ° C, למהול אותו 1:4 במלח סטרילית (ריכוז סופי 0.5 מ”ג/מ”ל) במזרק 1 מ”ל.להגן על המזרק מפני האור ושימוש µL 200 לכל עכבר אחד. בדיקת מצבים שונים: (1) הזרקה של acridine כתום עם הצנתר צוואר; (2) הזרקה של acridine כתום ישירות לתוך הווריד לרוחב של הזנב (עם מצב זה שהושתל צנתר צוואר אין); (3) מדידה מבלי acridine כתום באמצעות קרינה פלואורסצנטית את LysMCre+IRG+ עכברים (כאן שוב קטטר צוואר לא הושתל). ברגע הקטטר נמצא במקום שני לעורק הראש מבודדים, מיקום העכבר מתחת למיקרוסקופ. לבצע מדידות עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות שדה רחב במהירות גבוהה תוך שימוש הקבל למרחקים של 10 X (NA 0.3) המטרה טבילה במים עם monochromator, מפצל קרן מצלמה תשלום מצמידים מכשיר. בצע ייבוא תמונות וניתוח מערכת הדמיה בזמן אמת. פוקוס המטרה מיקרוסקופ באמצע העורק הראשי על פני אנדותל. לאט לאט להחדיר 50 µL של acridine כתום (0.5 mg/mL) (קח בחשבון נפח מת של הצנתר על הזריקה הראשונה). להגדיר את התוכנה כדי להקליט תמונות 100 עם זמן חשיפה בלתי המילישניות 120 לכל תמונה. להפוך ארבעה קטעי וידאו לפי העורק הראשי (ימין ושמאל) במקומות שונים על העורק עבור כל קליפ. אם האות פלורסצנטיות יורדת, להזריק עוד 50 µL של acridine כתום. לאחר הקלטת כל קטעי וידאו להרדימו על ידי נקע בצוואר הרחם. להגדיר את מהירות וידאו-10 תמונות בשנייה, לכמת את התאים מתגלגל, חסיד בתצוגה מיקרומטר 200 x 250 מיקרומטר מלבן במרכזו את הכלי עבור כל קליפ. ספירת תאים מתגלגל, חסיד; תאים חסיד מוגדרים תאים לא לזוז או להתנתק מהתכונה אנדותל בתוך הוידאו s 10. כדי לפשט כמת, להסיר את הערוץ עם פלואורסצנטי אדום ולהשתמש רק את הירוק פלורסצנטיות לספור תאים מתגלגל, והקפדה. לניסויים באמצעות acridine כתום, להפוך את הסף ידנית של זריחה כדי להסיר את הרקע שנעשו על ידי תאי אנדותל.