Un protocollo per la produzione di vettori lentivirali integrasi-carenti per CRISPR/Cas9-mediata Knockout del Gene nelle cellule in divisione

Gene preciso editing costituisce la pietra miliare dei principali progressi biomedici che coinvolgono lo sviluppo di nuove strategie per affrontare le malattie genetiche. At l’avanguardia delle tecnologie di modifica del gene è il metodo basandosi sull’uso della clustered regularly –ionterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / sistema di Cas9 che inizialmente è stato identificato come componente dell’immunità batterica contro l’invasione di materiale genetico virale (rivisto in riferimenti^1,2). Un grande vantaggio del sistema CRISPR/Cas9 rispetto ad altri strumenti di modifica del gene, quali nucleasi a dita di zinco (ZFNs) e nucleasi di attivatore-come effettore di trascrizione (TALENs) (rivista in riferimento³), è la relativa semplicità del design di plasmide e costruzione di componenti CRISPR — una caratteristica che ha alimentato l’espansione del gene-editing da pochi laboratori specializzati per una comunità di ricerca molto più ampia. Inoltre, la semplicità di programmazione CRISPR/Cas9 e la sua capacità per riconoscimento multiplex target hanno ulteriormente alimentato la sua popolarità come una tecnologia conveniente e facile da usare. Tra i vari metodi disponibili per i ricercatori di consegnare tali componenti modifica del gene delle cellule, vettori virali restano di gran lunga il sistema più popolare ed efficace.

Vettori lentivirali (LVs) sono emersi come il veicolo della scelta per fornire i componenti di CRISPR/Cas9 sistema in vivo per diverse applicazioni^4,5,6,7. Diverse caratteristiche chiave rendono LVs una scelta popolare per questo processo inclusa la capacità di infettare sia separazione e divisione di celle, bassa immunogenicità e minima tossicità cellulare (rivisto in riferimento⁸). Di conseguenza, la terapia genica mediata da LV è stata impiegata nei trattamenti di malattie infettive come l’HIV-1, HBV e HSV-1, come pure nella correzione dei difetti alla base di malattie ereditarie umane, come la fibrosi cistica e degenerazione maculare neo-vascolare ^{4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11}. Inoltre, LVs sono stati modificati in modo efficace per eseguire multisala gene editing presso distinti loci genomici utilizzando un singolo vettore sistema¹².

Tuttavia, la proprietà intrinseca di LVs per integrare nel genoma ospite possa essere mutagenica e spesso ostacola la loro utilità come veicoli di consegna del transgene, specialmente nelle regolazioni cliniche. Inoltre, poiché LVs stabilmente integrato esprimono loro transgeni a livelli elevati in modo sostenibile, questo sistema è inadeguato per la consegna del gene di modifica di componenti quali CRISPR/Cas9; sovraespressione di RNA Cas9-guida (gRNA) e di proteine simili come ZFNs, sono associati con i livelli elevati di effetti fuori bersaglio, che comprendono mutazioni indesiderate^{13,14,15,16 , 17} e può potenzialmente migliorare la citotossicità¹⁸. Pertanto, per raggiungere precisi gene-editing con effetti minimi fuori bersaglio, è imperativo per progettare sistemi che consentono l’espressione transitoria del gene componenti editing.

Negli ultimi anni, una varietà di piattaforme di distribuzione sono stati sviluppati per esprimere transitoriamente CRISPR/Cas9 in cellule^16,19,20,21 (recensione in riferimento²²). Questi includono metodi che si basano sull’introduzione direttamente Cas9 purificata con il RNAs guida appropriata nelle cellule, che è stato indicato per essere più efficace al gene-editing mirato rispetto al plasmide-mediata transfezione¹⁶. Gli studi hanno dimostrato che ribonucleoproteina (RNP) complessi costituiti guidano RNA/Cas9 particelle sono girate rapidamente dopo che mediano la fenditura del DNA alle loro destinazioni, suggerendo che a breve termine espressione di questi componenti è sufficiente per raggiungere gene robusto¹⁶di editing. In teoria, non integrando piattaforme vettore virale adeno-associato di vettori virali (AAVs) in grado di fornire una valida alternativa per fornire macchinari modifica del gene alle cellule. Purtroppo, capsidi AAV possiedono capacità di imballaggio significativamente più bassa rispetto alla LVs (< 5kb), che ostacola gravemente la loro possibilità di confezionare il toolkit multi-componente CRISPR all'interno di un singolo vettore (rivisto in riferimento⁸). Vale la pena notare che l’aggiunta di composti che inibiscono istone deacetilasi (ad es., sodio butirrato²³) o ostacolare il ciclo cellulare (per esempio, caffeina²⁴) hanno dimostrato di aumentare i titoli lentivirali. Nonostante i recenti progressi, i sistemi di espressione transiente sviluppati finora sono ancora ostacolati da varie carenze, come l’efficienza di produzione inferiore, che portano a titoli virali ridotti e l’efficienza di trasduzione basso dei virus generato attraverso tali approcci²⁵.

Integrasi-carenti vettori lentivirali (IDLVs) rappresentano un avanzamento importante nello sviluppo di veicoli di consegna del gene, come essi combinano la capacità di confezionamento di LVs con il beneficio aggiunto di manutenzione episomal AAV-come nelle cellule. Queste funzionalità consentono di IDLVs in gran parte eludere i problemi principali connessi con l’integrazione di vettori, vis-à-vis continua sovraespressione di potenzialmente genotossici elementi e integrazione-mediata mutagenicità. È stato precedentemente dimostrato che IDLVs possa essere modificata correttamente per migliorare il gene episomal espressione^26,27. Per quanto riguarda la consegna di IDLV-mediata CRISPR/Cas9, i titoli di bassa produzione e bassa espressione di genomi episome-sopportate relativi agli impianti lentivirali integrasi-competente limita la loro utilità come strumenti di bona fide per la consegna di modifica del genoma costrutti transgenici. Recentemente abbiamo dimostrato che sia l’espressione del transgene e titoli virali associati IDLV produzione aumentano significativamente con l’inclusione di siti per il fattore di trascrizione Sp1 all’interno l’espressione virale cassetta²⁸di legame. Il IDLVs modificate robustamente supportate CRISPR-mediata del gene editing sia in vitro (in cellule HEK 293T) e in vivo (nei neuroni post-mitotici cervello), mentre induce mutazioni di fuori bersaglio minime rispetto ai corrispondenti ICLV-mediata sistemi²⁸. Nel complesso, abbiamo sviluppato un romanzo, compatto, all-in-one toolkit CRISPR trasportato su una piattaforma IDLV e delineati i vari vantaggi dell’utilizzo di un veicolo di consegna per l’editing avanzato gene.

Qui, il protocollo di produzione del sistema IDLV-CRISPR/Cas9 è descritto, compreso i vari passaggi nell’Assemblea, la purificazione, la concentrazione e la titolazione di IDLVs, nonché strategie per convalidare l’efficacia della modifica del gene di questi vettori. Questo protocollo è facilmente scalabile per soddisfare le esigenze di diversi ricercatori ed è progettato per generare dei vettori-LV con i titoli con successo nella gamma di 1 x 10¹⁰ transducing unità (TU) / mL. I vettori generati attraverso questo protocollo possono essere utilizzati per infettare in modo efficiente diversi tipi di cellule diverse, tra cui difficile per trasdurre staminali embrionali, cellule ematopoietiche (cellule T e macrofagi) e coltivate e vivo in– neuroni iniettati. Inoltre, il protocollo è ugualmente adatto per la produzione di vettori lentivirali integrasi-competente in quantità simili.

Figura 1: imballaggio di IDLV. (a) schema di tipo selvaggio dell’integrasi proteina (b) il plasmide modificato è stato derivato da psPAX2 (vedere Metodi, costruzione del plasmide per dettagli). Immagine di gel di agarosio rappresentante dei cloni schermati per cloni mutati integrasi. Campioni di DNA preparati utilizzando un mini-kit di isolamento del DNA del plasmide standard sono stati analizzati tramite digestione con EcoRV e SphI. Il clone correttamente digerito (numero 5, casella rossa tratteggiata) è stata ulteriormente verificato mediante sequenziamento diretto (Sanger) per la sostituzione di D64E in INT. La cassetta di imballaggio dell’integrasi-carente è stata denominata pBK43. (c) schema del protocollo trasfezione transiente impiegato per generare dei vettori-IDLV-CRISPR/Cas9, mostrando 293T cellule trasfettate con VSV-G, imballaggi e cassette transgene (Sp1-CRISPR/Cas9 all-in-one plasmide). Le particelle virali che bud fuori dalla membrana cellulare contengono il RNA Full-Length del vettore (espresso dal cassetto transgene). La seconda generazione del IDLV-packaging system è stata utilizzata, che comprende le proteine regolarici Tat ed espressione Rev Rev. è inoltre integrata da una cassetta separata (RSV-REV-plasmide). Abbrev: virus di stomatite vescicolare ripetere, VSV-G, LTR-Long-terminale G-proteina, promotore pCMV-citomegalovirus; Promotore di Rous sarcoma virus (RSV); RRE-(elemento di risposta Rev). Altri elementi regolatori della cassetta di espressione comprendono siti di legame per Sp1, elemento Rev Response (RRE), marmotta epatite Virus Posttranscriptional Regulatory Element (WPRE), promotore di un nucleo-allungamento fattore 1 α (EFS-NC), l’imballaggio di vettore elemento ψ (psi), promotore umano di citomegalovirus (hCMV) e promotore umano U6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.