JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Imunologia e Infecção

Co kultur metode å undersøke Crosstalk mellom X-ray bestrålt Caco-2 celler og PBMC

Published: January 30, 2018
doi:
10.3791/56908
, , , , , , ,
1Dipartimento di Fisica,Università degli Studi di Pavia, 2IRCCS Istituti Clinici Scientifici Maugeri

Summary

Vi presenterer en protokoll for å undersøke crosstalk mellom X-ray-bestrålt Caco-2 og perifert blod mononukleære celler (PBMC). Protokollen starter med Caco-2 bestråling og oppsett av co kultur med PBMC; deretter måles trans-epitelial motstand jevnlig over 48 h og western blot i både Caco-2 og PBMC.

Abstract

Protokollen vedtatt i dette arbeidet tar sikte på å rakne hvordan røntgenstråler forurolige funksjon av intestinal barriere, med fokus på samspillet mellom colorectal kreftceller og immunsystemet. Colorectal carcinoma er blant de fleste vanlig type av kreft, vanligvis behandles med kirurgi, kjemoterapi og strålebehandling. Fordelene med strålebehandling i målretting svulsten er godt kjent. Men er begrenset eksponeringer av sunt vev til stor bekymring, spesielt om virkningene på intestinal barriere og immunsystemet. Vedtatt oppsettet tillater for å studere samspillet mellom to celle populasjoner i stand mer lik den fysiologiske, sammenlignet med normal cellekulturer. For dette formålet, vi ty til ulike teknikker og vi brukte en i vitro co kultur modell, basert på Caco-2 celler differensiert som monolayer og PBMC, deler den samme kultur mediet. Denne protokollen er utviklet til å fokusere på både makroskopisk effekter, dvs celle levedyktighet og Trans-epitelial elektrisk motstand (TEER), og gjennom western blot, molekylær endringer, dvs aktivering av inflammatoriske pathway i immunceller og tett krysset protein uttrykk i Caco-2 celler. Innledende vurdering av stråling effekter på Caco-2 celle levedyktighet ble vurdert via 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) og Trypan blå analyser, mens TEER ble målt ved faste tidsintervaller gjennom en ohmmeter spesielt utformet for co kultur systemer. På denne måten kan effektene stråling, tilstedeværelse av perifert blod mononukleære celler (PBMC), og til slutt deres synergistisk effekt, påvises. Gjennom disse utfyllende teknikker observerte vi en høy radio-motstand av Caco-2 innen 2-10 Gy av røntgenbilder og en økt Caco-2 monolayer permeabilitet når PBMCs ble lagt til. Spesielt ble PBMC tilstedeværelse funnet for å være assosiert med variasjonen i tett krysset stillaset proteiner uttrykket.

Introduction

Metodikken i dette arbeidet ble utformet å undersøke samspillet mellom tykktarmskreft celler og immunsystemet, utnytte et oppsett nærmere til fysiologiske tilstanden sammenlignet med normal 2-dimensjonal cellekulturer.

Colorectal karsinom (CRC) anses tredje hyppigste type kreft, med mer enn én million tilfeller globalt (Global kreft Observatory, International Agency for forskning på kreft, Verdens helseorganisasjon, http://gco.iarc.fr). Styring av CRC utføres rutinemessig enten kirurgi, kjemoterapi eller strålebehandling1. Sammenlignet med invasiv teknikker som kirurgi eller kjemoterapi, unngår strålebehandling i stor grad de typiske skadelig systemisk reaksjonene avledet fra disse kliniske tilnærminger, takket være lokalisert levering av stråledose. Imidlertid kan bivirkninger oppstå i omkringliggende sunt vev, utløser betennelse med direkte skade friske celler og skade mediert av ikke-målrettede effekter2,3,4. Fokusere på negative effekter på grunn av irradiation under kolorektal kreftbehandling, må to aspekter undersøkes. Først kunne mekanismene ansvarlig for intestinal varmeisolerende endres av stråling levering forårsaker, i sin tur muligheten for bivirkninger på grunn av en endret kontroll av bakteriell befolkningen og paracellular tidens molekyler og solutes. Andre fungerer tilstedeværelsen av gut-assosiert lymfatisk vev (GALT) som en utpost av immunsystemet, med funksjonen kontrollere bakterievekst og formidle den generelle immunforsvar5,6,7. For å oppfylle disse funksjonene, holdes intestinal varmeisolerende på grunn av funksjonen for junctional komplekser mellom cellene membraner. For disse grunner, ble de indusert ødeleggende konsekvensene forskjellige doser av røntgen undersøkt i Caco-2 celler alene og i co kulturer med PBMC.

Selv om gjennomføre studier på cellekulturer er den første setline av etterforskning i biomedisinsk forskning, kan mangel på detaljert kunnskap om mekanismer kjøring celle biologi og gjensidig interaksjon mellom ulike celletyper bli kritisk når nærmer studiet av fysiologi av organer og systemer apparatene som lett ikke kan gjenopprettes i laboratoriet. Derfor har vi besluttet å vedta en co kultur oppsett, slik at både studiet av to celle populasjoner sammen og Disseksjon av aspekter knyttet til intercellulære og ekstracellulære.

Co kultur er en teknikk utnyttes når studere epithelial funksjoner og samspillet mellom forskjellige celletyper. Spesielt blir bruk av slike en teknikk obligatorisk i vårt tilfelle, fordi epithelia er laget av celler preget av polaritet. I tilfelle av intestinal barriere, enterocytes viser en veldefinert polarisering, med apikale og basolateral polakkene atskilt normalt av tett krysset-opprette vedheft molekyler. Dette compartmentalization kreves for vev fysiologi, unngå paracellular handel og tillate passasje av bestemt molekyler bare. Denne funksjonen er umulig å gjenskape med en normal celle dyrking oppsett. Videre gjengir adopsjon av co kultur oppsettet tilstedeværelsen av immunceller i basolateral overflaten, mens den apikale overflaten (tilsvarende intestinal lumen) ikke er direkte i kontakt med andre celler.

Nylig fikk Caco-2 linjer mer betydning som en i vitro modell av intestinal barriere. Selv om avledet fra menneskelige kolon adenocarcinoma, Caco-2 celler opprettholde differensiering evne og opprette en funksjonell polarisert monolayer8, som gjør etterforskningen av cellemembranen egenskaper når dyrket i en co kultur setter.

Siden Caco-2 dyrking på en porøs membran er en godt etablert i vitro modell av intestinal monolayer, har en forbedring vært co kultur mellom Caco-2 og andre celler. Dette oppsettet er vedtatt ofte til mål crosstalk mellom ulike celle typer9 og kan brukes til å løse Caco-2 opprørt respons på ytre stimuli i co kultur, med hensyn til Caco-2 kultivert alene.

Mange studier har adressert Caco-2 når co kultivert med både ikke-patogene bakterier og perifere blod mononukleære celler, å belyse spesielt crosstalk med immunsystemet10. Pozo-Rubio et al. 11 studerte uttrykket av flere cytokiner i en co Caco-2/PBMC-kultur med bifidobacteria stimulere Caco-2 celler. Deres arbeid fremhevet betydelig endring cytokin uttrykket profiler avhengig av bakteriell stimulering i tilstedeværelse/fravær av PBMC. Resultatene føre til konklusjonen at tilstedeværelsen av PBMC sensitizes Caco-2 til bifidobacteria.

Forskjellige svar Caco-2 celler til ikke-patogene og patogene bakterier har vurdert av ulike forskergrupper. Parlesak et al. 12 vist suppressive effekten av Caco-2 celler på Escherichia coli-stimulert PBMC. Videre Haller et al. 13 studerte svaret av Caco-2 celler stimulert med både lipopolysakkarid (LPS) fra enteropathogenic E. coli spp. eller ikke-enteropathogenic bakterier i.e.E. coli spp., Lactobacillus spp., styrke den gjetning at Caco-2 cellene svar strengt avhenger av tilstedeværelsen av leukocytter i co kultur oppsettet.

Ved å utføre forskjellige komplementære laboratorium analyser (f.eks western blot, trans-epitelial motstand, MTT, etc.), i tillegg til analysen av forskjellige celletyper vokst co kultur, hele metodikken lover resultater som kan betraktes som mer representativt for hva som virkelig skjer i vivo. Videre er muliggjør dette oppsettet separasjon av de forskjellige co kultur avdelinger, slik at ikke bare studere i celletyper involvert, men også intercellulære signalnettverk molekylene utgitt i øvre og nedre rommet eller i nærvær g. fravær av co kultur.

Protocol

Følgende protokollen innebærer menneskeblod tilbaketrekning fra friske frivillige. Givere gitt skriftlig samtykke før registrering. Denne fremgangsmåten er Helsinki erklæringen og blod uttak ble utført av en profesjonell healthcare assistent. 1. celle kultur og co kultur oppsett En uke før bestråling, forberede en Caco-2 celle suspensjon som inneholder 2,5 × 105 celler/mL i frisk RPMI1640 medium med 10% fosterets bovin serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin. Frø 2 mL celle suspensjon i sterilt 1 µm-pore diameter cellekultur setter for 6-vel plater og sette innsatsen i en 6-vel plate.Merk: Celle kultur setter må kanskje aktiveres ved inkubasjon med sterilt komplett medium før cellen seeding. I dette tilfellet bør kultur medier ignoreres og erstattet med cellen suspensjon media. Legg 3 mL frisk RPMI1640 medium med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 IU/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin i hver nederste, og kultur cellene på 37 ° C i en inkubator fuktet atmosfære som inneholder 5% CO2. På samme dag av Caco-2 celle bestråling, samle menneskelig fullblod i kommersielt tilgjengelige lithium-heparin belagt 6 mL rør (rør størrelse: 13 x 100 mm). Deretter isolere perifert blod mononukleære celler (PBMC) ved hjelp av Ficoll gradering. Skille PBMC, sette 25 mL av Ficoll i en 50 mL konisk sentrifuge rør og lag en lik mengde fullblod fortynnet 1:1 med RPMI1640 på Ficoll overflaten.Merk: En normalt frisk donor har vanligvis ca 4-10 × 106 PBMC/mL. Sentrifuge 50 mL rørene på 400 x g i 30 min ved romtemperatur. Samle PBMC i grensesnittet mellom Ficoll og plasma av aspirasjon med en Pasteur pipette og sette dem i en 15 mL konisk rør forsiktig. Vask PBMC to ganger ved å legge 10 mL fosfat bufret saltoppløsning (PBS) og sentrifugering PBMC 250 x g i 10 min. Kultur PBMC maksimalt 3-5 h i T25 cm2 flasker i fullføre RPMI1640 media, som beskrevet tidligere, på 37 ° C i en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO2.Merk: Samle PBMC på eksperimentet dag og frø 2 × 106 celler/Vel, suspendert i 3 mL komplett RPMI1640 medium, nederste co kultur. Setter inn med Caco-2 celler overføres i PBMC inneholder brønner 30 min etter deres bestråling. PBMC samlet fra hele blod kan ikke være vedlikeholdes i kultur mer enn omtrent 72 h, om ikke stimulert med f.eks. phytohaemagglutinin (PHA), etter som cellene levedyktighet er tapt.FORSIKTIG: Kvaliteten og sikkerheten av alle blod og blodprodukter må garanteres gjennom hele prosessen. 2. bestråling oppsett Merk: Bestråling av Caco-2 celler ble utført på strålebehandling departementet Istituto di Ricovero e Cura en Carattere Scientifico (IRCCS) S. Maugeri (Pavia, Italia) med en lineær akselerator rutinemessig brukes til å behandle ulike typer av kreft. Angi Foton røntgenstråler energi 6 MV topp. Lineære akseleratoren opererer i et pulserende regime (mellom to påfølgende pulser ca av 4 ms, varigheten av en enkelt puls om 5 µs med en dose rate opptil 1 × 10-3 Gy/p). Plass 6-vel platene som inneholder innlegg med Caco-2 på banen for røntgen på en 1.4 cm-tykke plexiglass ark (tilsvarende avstand litt større enn oppbygging av brukte stråling) på 100 cm fra kilden til stråling. Plass 0,5 cm-tykke bolus på hvert utvalg før irradiation for å garantere komponenten backscattered stråling og ladede partikler likevekt. Irradiate cellene (doser i området 2-10 Gy) med en flat og symmetrisk (± 2%) 20 x 20 cm2 stråling-feltet og en dose-rate på 3 Gy/min.Merk: Kontrollere “humbug”-bestrålt celler gjennomgikk fremgangsmåter for vilkårene av de bestrålt, uten å angi bestråling rommet (mottatt dose: 0 Gy).FORSIKTIG: ioniserende stråling-produserende enheter må brukes bare av spesialiserte personell. 3. celle levedyktighet analysen (MTT analysen) Merk: Caco-2 celle metabolsk aktivitet ble vurdert gjennom den 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) analyse14. Frø 2 × 105 Caco-2 i en 24-vel plate 24 timer før bestråling i 1,25 mL av komplett medium. Irradiate cellene som beskrevet i trinnene 2.1-2.4 og ruge cellene på 37 ° C i en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO2. 21 h etter bestråling, Legg 100 µL av 5 mg/mL MTT løsning og holde cellene på 37 ° C i en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO2 3 h. Forkaste nedbryting og vask cellene med 1 mL av PBS. Oppløse formazan krystaller ved å legge 500 µL av dimethyl sulfoxide (DMSO) i hver brønn og evaluere absorbansen med en flere godt plate leser på λ = 570 nm. Gjenta trinn 3.3-3.4 – 3,5-3.6 på 45 h etter bestråling.Merk: Resultatene vises som en forstyrrelsene fra tilsvarende humbug tilstanden, som er normalisert til 100%.FORSIKTIG: DMSO er brennbare og irriterende agent for hud, øyne og luftveier (GHS07, GHS08). Ved kontakt med øyne, vaskes straks med rikelig vann og søke legehjelp. MTT er irriterende agent for hud, øyne og luftveier (GHS07, GHS08). Ved øynene stoffet med vann og søke legehjelp. 4. andelen levedyktige cellers vilje (Trypan blått fargestoff utelukkelse analysen) Merk: Prosentandel av levedyktige cellers ble vurdert av Trypan blå fargestoff utelukkelse analysen. Frø 2 × 105 Caco-2 i 24-vel plate 24 timer før bestråling i 1,25 mL av komplett medium. Irradiate cellene med doser i området 0 – 10 Gy (se trinnene 2.1-2.4) deretter ruge cellene på 37 ° C i en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO2 24-48 h. Etter to valgte tiden poeng, vaske cellene med PBS, kaste den, og deretter legge 100 µL av Trypsin-ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) løsning. Sette cellene på 37 ° C i en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO2 i 2 minutter, deretter legge fullstendig medium for å arrestere den enzymatiske reaksjonen. Samle inn cellene i et 1,5 mL-rør og sentrifuge røret på 500 x g for 5 min. Forkast nedbryting og re suspendere cellene i 50 µL av PBS. Bland celle suspensjon med 50 µL Trypan blått fargestoff løsning og ruge blandingen for 3 min ved romtemperatur. Greven de farget (ikke-levedyktige) og unstained kvinne (levedyktig) celler med en Bürker kammer. 5. Trans-epitelial motstand (TEER) Frø 5 × 105 Caco-2 celler en uke før bestråling i 6-vel plate co kultur inserts (polyetylentereftalat (PET), 2 x 106 porene/cm2). 1 time før bestråling, måle TEER med et voltmeter/ohmmeter. Irradiate celler som beskrevet i trinnene 2.1-2,4. Inkuber Caco-2-celler i tilstedeværelse/fravær av co kultur med PBMC på 37 ° C i en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO2. For det første få timer etter irradiation, måle TEER hver time, og deretter hver 3t opptil 48 h. 6. Western Blot analyse av Claudin-1, Occludin, Afadin, ZO-1, ZO-2, NF-kB og XIAP Frø 5 × 105 celler 1 uke før røntgenstråler eksponering i 6-vel plate co kultur setter inn (PET, 2 x 106 porene/cm2) og irradiate celler som beskrevet i trinnene 2.1-2,4. Inkuber Caco-2-celler i tilstedeværelse/fravær av co kultur med PBMC på 37 ° C i en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO2. 48 timer etter bestråling, klargjør Caco-2 og PBMC celle lysates ved behandling av celler med cellen lysis buffer og lagre prøver på 20 ° C.Merk: protokollen kan pauses her. Kvantifisere totale protein beløpet av bicinchoninic syre (BCA) metoden.Merk: protokollen kan pauses her. Bland like mye totalt proteiner med Laemli eksempel Buffer lagt med β-mercaptoethanol (siste konsentrasjon av β-mercaptoethanol er 5%), varme prøvene ved 95 ° C i 5 min og spinne dem på 10.000 x g. Belastning i en 4-20% precast gel og utføre geleelektroforese på 120 V for 1 h. overføring proteiner på en polyvinildiene fluor (PVDF) membran. Blokkere ikke-spesifikk bindende ved rugende PVDF membran ved romtemperatur med 5% ikke-fett tørr melk (NFDM) i PBS lagt med 0,2% Tween-20 (PBT). Vask membranen tre ganger med 10 mL 0,2% PBT i 5 min. Inkuber membranen med mild agitasjon 1t ved romtemperatur før plasseres over natten ved 4 ° C med følgende primære antistoffer: anti-claudin-1, anti-ZO-1, anti-ZO-2, anti-afadin, anti-occludin, anti-NF-kB, anti-XIAP og anti-utgangen. Vask membranen tre ganger med 10 mL 0,2% PBT i 5 min. Inkuber membraner med pepperrot Peroxidase HRP-konjugerte sekundære antistoffer 1t ved romtemperatur med mild agitasjon. Vask membranen tre ganger med 10 mL 0,2% PBT i 5 min. I romtemperatur, utvikle fotografiske filmer av rugende membraner med forbedret chemo-selvlysende kit. Tilegne seg fotografiske filmer med en skanning og kvantifisere innhentet band med passende bilde analyseprogramvare.Merk: Evaluering av Claudin-1, Occludin, Afadin, ZO-1 og ZO-2 utføres i Caco-2 celler. Evalueringen av NF-kB og XIAP utføres i PBMC.FORSIKTIG: β-mercaptoethanol er giftige (GHS05, GHS06, GHS08, GHS09). Ikke puster gasser, unngå utslipp til miljøet, og personlige enheter og åndedrettsvern. Svelging umiddelbart be for medisinske råd. 7. statistisk analyse For å fastslå om stråling og co kulturen induserer en statistisk signifikant forstyrrelsene, utføre en toveis variansanalyse (ANOVA) test med flere sammenligninger for gjentatte målinger (med Bonferroni innlegg-hoc tester sammenlignes replikere betyr). Hvis ikke annet er oppgitt, beregne den statistiske betydningen (p) av tosidige Student t-test. Hver verdi er gjennomsnittet av ≥3 uavhengig eksperimenter ± standardfeil av mener (SEM).

Representative Results

En uke før eksperimentet er celler sådd på porøs membran av innsatsen og lov til å vokse under følgende dager. Nivået av samløpet kan kontrolleres ved hjelp av enten en invertert mikroskop eller via måling av TEER verdiene. Faktisk i fasen for vekst holder TEER økt før alle porøs membran er dekket av celler og de danner en differensiert celle monolayer. Hvis celler sprer raskere/lavere, kan eksperimentet starte på tidligere/senere tidspunkt etter tilværelse frø. Når du er på samløpet, cellene blir så brakt til funksjonen bestråling, minimere den formidles miljøstress (temperatur eller pH), før du starter co kulturen med/uten PBMC, seeded i nederste (figur 1A), eller evaluerer spredning av Caco-2 celler. Gitt den innledende seeding tettheten, på dagen skal 0 celler nå 100% samløpet og opprette en differensiert monolayer av epitelceller, som kan observeres av platået i TEER som vist i figur 1B. Når cellene når slik status, beholdes TEER verdien relativt konstant over neste uke, så lenge den gamle kultur mediet erstattes med frisk medium, minst en gang i uken (figur 1B). Som vist i figur 1C, viser MTT analysen ikke noen statistisk signifikant endring av proliferativ status Caco-2 celler på 24 h verken på 48 h, uavhengig av dosen mottatt (opptil 10 Gy). Et annet resultat ble observert om kortsiktige dødeligheten av Caco-2 celler. På begge tidspunkt, Trypan blå flekker viser en doseavhengig økning i cellen dødelighet. Disse resultatene viser en klar effekt av stråling, men prosenter av døde celler synes å være svært lav, spesielt når de vurderer at den høyeste leverte dosen (10 Gy) produserer bare ca 20% av celledød (figur 1D). Prøvene var co kulturperler med eller uten PBMC i nedre rommet. Gitt det faktum at PBMC ikke får noen ekstern stimulans til spredning, ble en 48t eksperiment ansett ideelt å unngå bias introdusert av PBMC begynner å dø. Derfor ble fra umiddelbart før bestråling, TEER regelmessig målt 48 h, å holde styr på mulig overgangseffektene skyldes bestråling protokollen. Som vist i figur 1 E-F, TEER verdier presenteres som relative variasjoner til pre-behandlet vilkåret (som var av 1200-1500 Ω·cm2) bedre høydepunkt forstyrrelsene indusert av X-ray bestråling og / eller ved tilstedeværelse/fravær av PBMC i co kultur. I begge tilfeller, kan en innledende forbigående topp tydelig ses på første gang punktet etter stråling, som kan tilskrives bestråling prosedyren. Når ikke i co kultur med PBMC (figur 1E), TEER verdier er nesten konstant opp til 48 timer mens, etter 10 Gy av røntgenbilder, celler Vis en langvarig nedgang i TEER begynner på 3t post-bestråling. Tilstedeværelsen av PBMCs endrer helt TEER timelige dynamikken (figur 1F). For alle doser er en reduksjon i TEER tydelig viser 3t til ca 30 timer etter bestråling, når TEER synes å bosette seg på en konstant verdi (figur 1F). Tett krysset komplekser uttrykk nivåer ble undersøkt i Caco-2 celler lysates gjennom western blot analysen. Caco-2 celler ble utsatt for ioniserende stråling (med doser på 0, 2, og 10 Gy) og senere vokst alene eller co kultur med PBMCs i nederste 48 h (som vist i figur 2A-F). Både Claudin-1 og Occludin (figur 2A, 2B) ble funnet å være ikke betydelig endret av X-ray og/eller co kultur med PBMC. Store svingninger ble i stedet observert i stillaset proteiner ZO-1, ZO-2 og Afadin (figur 2C, 2D, 2E). Spesielt er en reduksjon i ZO-2 uttrykk nivåer observert allerede etter 2 Gy i co kultur med PBMC bare på 10 Gy når Caco-2 vokste alene. Afadin uttrykk nivåer i stedet berøres bare etter 10 Gy av røntgenbilder, med et ytterligere reduksjon når Caco-2 er co kulturperler med PBMCs. PBMCs co kultivert med Caco-2 ble analysert om inflammatorisk tilstanden, spesielt kjernefysisk transkripsjon faktor kB (NF-kB) og den X-tilknyttet inhibitor av apoptose protein (XIAP) har blitt undersøkt (figur 2 G-jeg). NF-kB totale beløpet var ikke påvirket av co kulturen med Caco-2 utsettes for forskjellige strålingsdoser (figur 2G). Tvert imot, ble XIAP nivåer 4-fold opp-regulert i både den 2 Gy og 10 Gy co kulturer, selv om de store variasjonene krever et større antall prøver analysert for å redusere slike svingninger og få en bedre statistisk makt. Som vist i figur 2F og 2I, kan noen ikke-spesifikk band vises ved siden av den forventede Molekylvekten av protein av interesse. Hvis sann og uspesifikk band er lett identifiserbar, anses forskjellig antistoff og/eller BSA eller NFDM konsentrasjoner. Figur 1 . Samlet eksperimentelle oppsett og makroskopisk effekter av stråling og/eller PBMC co kultur. A) skjematisk fremstilling av co kultur modellen. B) TEER verdier målt daglig fra innledende frø av Caco-2 celler å vurdere riktig vekst og differensiering status for monolayer. C) cellen levedyktighet og D) dødelighet i Caco-2 eksponert for røntgenstråling (0, 2, 5 og 10 Gy). E) TEER målinger i Caco-2 celler bestrålt 0, 2 og 10 Gy av røntgenstråler kultivert uten eller F) med PBMCs. Hver verdi er gjennomsnittet for ≥3 uavhengig eksperimenter ± SEM. * p-val < 0,05; ** p-va l < 0.01; p-val < 0,001. Grafer tilpasset fra Morini et al. 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2. Western Blot resultatene av Caco-2 og PBMC lysates. Uttrykket nivå av tett krysset proteiner (Claudin-1 (A), Occludin (B), ZO-1 (C), ZO-2 (D) og Afadin (E)) i Caco-2 etter 0, 2 og 10 Gy av røntgenbilder og tilstedeværelse/fravær av PBMC i co kultur. Verdier er normalisert på utgangen nivå. Illustrerende filmer for hver tett krysset protein og betingelsene vises i panelet (F). Uttrykket nivå av NF-κB (G) og XIAP (H) i PBMCs co kultivert med Caco-2 celler. Representant filmer for NF-kB, XIAP og utgangen vises i panelet. Hver verdi er gjennomsnittet av ≥3 uavhengig eksperimenter ± SEM. grafer tilpasset fra Morini et al. 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Tykktarmskreft, med høy forekomst i utviklede land, er en av de vanligste årsakene til sykelighet og dødelighet i befolkningen. Det er vanligvis styrt av kirurgi, kjemoterapi og strålebehandling1. I rammen av strålebehandling behandlinger, må særlig oppmerksomhet gis til effekten av friskt vev eksponering4; Videre er systematiske studier på forholdet mellom stråling og immunsystemet grunnleggende for å utvikle tilnærminger av radio-immunterapi3.

Metodene vi vedtatt i dette arbeidet er tilpasset etterforskningen av Caco-2 celler og PBMC crosstalk. Vi fokuserer på effekten av røntgenstråler eksponering av kreftceller, men samme protokoll kan tilpasses til studier med farmakologiske agenter. Å være nærmere fysiologiske forhold med hensyn til standard celle dyrking, er sterk fordelen med denne metoden muligheten for et fullstendig Disseksjon av et komplekst system, gitt analysere både forskjellige celletyper og utgivelsen av signalet molekyler i de to avdelinger av co kulturen selv. På denne måten kan rutinemessig anvendt metoder hjelpe forståelse av mobilnettet samspill relaterte mekanismer.

Første karakterisering av X-ray-indusert effekter på Caco-2 celler var basert på to utfyllende målinger, MTT kolorimetrisk analysen og Trypan blå fargestoff utelukkelse test dvs . De tilsynelatende inkonsekvente resultatene kan forklares med forskjellig fokus for disse to analyser. MTT vurderer oxidoreductase enzym aktivitet, mens Trypan blå fargestoff er basert på en levende celle utelukkelse fargestoff mekanisme.

Etterforskningen av Caco-2-PBMC samspill krever etableringen av en epithelial monolayer kunne føre til en fullstendig skille mellom de to avdelinger av co kultur. Muligheten for såing Caco-2-celler i sette inn co kultur kan bestråling av bare celle befolkningen. Co kulturen starter etter bestråling, er det ingen skjevhet på grunn av noen utilsiktet eksponering av PBMC. Dette oppsettet må håndteres forsiktig for å unngå skade (eller forurensning) i cellular monolayer under bevegelser av sette fra en 6-vel plate til den andre. Når nøye utført, er TEER målinger en enkel og ikke-invasiv metode for å undersøke monolayer permeabilitet. Denne analysen er strengt knyttet til co kultur-oppsett, og det er ikke det eneste valget for undersøkelse av monolayer permeabilitet. Det gjør en god reproduserbarhet tiltak når det er godt kalibrert med fersk komplett medium. Felles analyser fokusere på spredningen av kjemiske fargestoffer fra øvre “apikale” rommet til bunnen “basolateral” en (f.eks fluorescein isothiocyanate (FITC)-dekstran analysen)16. Men siden PBMC finnes i basolateral rommet i denne studien, besluttet vi å unngå innføring av kjemiske reagenser i forsøkene.

Blant de ulike teknikkene i dette arbeidet, er TEER måling det eneste som krever co kultur oppsett17,18. Men gi de andre vanlige laboratorium teknikkene mer informative resultater når brukt på celler i co kultur, som de tillater etterforskningen av en setup nærmere fysiologiske forhold og dataene har en sterkere biologisk betydning. På den annen side, må det bemerkes at bruken av celler dyrket på en porøs støtte kan føre til noen problemer i operasjoner måtte forberede utvalgene, for eksempel celle lysis for utarbeidelse av mobilnettet ekstrakter skal analyseres gjennom vestlige blotting.

Systemet innført i denne studien har potensial til å bli ytterligere forbedret, f.eks med anvendelse av stoffer kan gjenskape ekstracellulær matrix miljøet. Men dette vil også resultere i en økt kompleksitet av systemet, og en komplett Disseksjon av oppsettet blir vanskeligere å oppnå.

Oppsett for co cellekultur sikkert representerer et kraftig verktøy for fremme av i vitro forskning og forståelse av komplekse systemer. Denne teknikken har potensial til å øke kunnskap om grunnleggende mekanismer, gir nye innganger til grunnleggende forskningsstudier molekylær signalering og med mulig programmer modulering av aktiviteten av immunsystemet i rammen av oncological kliniske pasient ledelse.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Italiensk Institutt for kjernefysikk (INFN) finansiert delvis dette arbeidet gjennom INFN-MERIDIAN prosjektet. Forfatterne bekrefter Prof Edoardo Milotti (fysikk avdeling, Universitetet i Trieste, Italia) for INFN-MERIDIAN prosjektkoordinering; Dr. Roberto Chignola (bioteknologi Institutt, Universitetet i Verona, Italia) for å gi Caco-2 celler, ohmmeter, og hans verdifulle hjelp og opplæring. Vi erkjenner også Agnese Solari for teknisk assistanse.

Materials

ThinCert
6 Well Cell Culture Inserts for Multiwell Plates		 Greiner Bio-one 657610 Equipment
Cell Culture Multiwell Plate, 6 Well  Greiner Bio-one 657160 Plastic
Cell Culture Multiwell Plate, 24 Well  Greiner Bio-one 662160 Plastic
RPMI 1640 without L-Glutamine Lonza 12-167F Reagents
Foetal Bovine Serum Lonza DE14-801 Reagents
L-Glutamine 200 mM Lonza 17-605C Reagents
Penicillin/Streptomycin  10K/10K Lonza 17-602E Reagents
CO2 Incubator Heal Force HF240 Equipment
Ficoll Histopaque-1077 Sigma-Aldrich 10771 Reagents
Tube, 50 mL, PP, Conical Bottom Greiner Bio-one 227261 Plastic
Tube, 15 mL, PP, Conical Bottom Greiner Bio-one 188261 Plastic
Centrifuge ThermoScientific CL31R Equipment
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P3813 Reagents
Cell Culture Flask, 25 cm2, PS Greiner Bio-one 690175 Plastic
Clinac 2100 Linear Accelerator Varian CLINAC 2100C/D Equipment
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) Sigma-Aldrich M5655 Reagents
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Reagents
Multiwell Plate Reader GDV DV990BV6 Equipment
Trypan Blue Solution 0,4 %  Amresco K940 Reagents
Trypsin-EDTA Solution Sigma-Aldrich T4049 Reagents
1.5 mL tubes Eppendorf 0030125150 Reagents
Millicell-ERS voltmeter/ohmeter Millipore MERS 00001 Equipment
Cell Lysis Buffer (10x) Cell Signalling Technology #9803 Reagents
Bürker Hemocytometer Sigma-Aldrich BR719520 Equipment
BCA Protein Quantification Kit Abcam ab102536 Reagents
2x Laemmli Sample Buffer  BioRad #1610737 Reagents
2-Mercaptoethanol  BioRad #1610710 Reagents
Accublock Digital Dry Bath Labnet International Inc. D1100 Equipment
4–20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 well, 30 µL BioRad #4568093  Reagents
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel BioRad #1658004 Equipment
PowerPac HC High-Current Power Supply BioRad #1645052  Equipment
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards BioRad #1610385  Reagents
10x Tris/Glycine/SDS Running Buffer BioRad #1610732  Reagents
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs BioRad #1704156 Reagents
Trans-Blot Turbo Transfer System BioRad #1704150 Equipment
Blotting-Grade Blocker  BioRad #1706404 Reagents
Tween-20 Sigma-Aldrich 93773 Reagents
Claudin-1 (D5H1D) XP Rabbit mAb  Cell Signalling Technology #13255 Reagents
Bovine Serum Albumine Sigma-Aldrich A7906 Reagents
ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb  Cell Signalling Technology #8193 Reagents
ZO-2 Antibody  Cell Signalling Technology #2847 Reagents
Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAb Cell Signalling Technology  #13531 Reagents
Anti-Occludin Antibody Millipore ABT146 Reagents
Anti-NF-kB p65 antibody [E379] Abcam ab32536 Reagents
Anti-XIAP antibody  Abcam ab21278 Reagents
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare Life Sciences NA931V Reagents
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare Life Sciences NA934V Reagents
Clarity Western ECL Substrate, 200 mL BioRad #1705060  Reagents
Carestream Kodak autoradiography GBX developer/replenisher Sigma-Aldrich P7042 Reagents
Carestream Kodak autoradiography GBX fixer/replenisher Sigma-Aldrich P7167 Reagents
Carestream Kodak BioMax light film Sigma-Aldrich Z370401 Reagents
Gel Doc EZ System BioRad #1708270  Equipment
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Cunningham, D., et al. Colorectal cancer. Lancet. 375 (9719), 1030-1047 (2010).
  2. Mancuso, M., et al. Oncogenic bystander radiation effects in Patched heterozygous mouse cerebellum. PNAS. 105 (34), 12445-12450 (2008).
  3. Demaria, S., Formenti, S. C. Can abscopal effects of local radiotherapy be predicted by modeling T cell trafficking. J Immunother Cancer. 4 (1), 29 (2016).
  4. Trott, K. R., et al. Biological mechanisms of normal tissue damage: Importance for the design of NTCP models. Radiother Oncol. 105 (1), 79-85 (2012).
  5. Derer, A., Deloch, L., Rubner, Y., Fietkau, R., Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy-induced immunogenic cancer cells as basis for induction of systemic anti-tumor immune responses – pre-clinical evidence and ongoing clinical applications. Front Immunol. 6, 505 (2015).
  6. Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy: The focused beam expands. Lancet Oncol. 16 (7), 742-743 (2015).
  7. Prise, K. M., O’Sullivan, J. M. Radiation-induced bystander signalling in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 9 (5), 351-360 (2009).
  8. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21 (1), 1-26 (2005).
  9. Babini, G., et al. Mechanisms of the induction of apoptosis mediated by radiation-induced cytokine release. Radiat Prot Dosim. 166 (1-4), 165-169 (2015).
  10. Pellegrina, C. D., et al. Effects of wheat germ agglutinin on human gastrointestinal epithelium: Insights from an experimental model of immune/epithelial cell interaction. Toxicol Appl Pharm. 237 (2), 146-153 (2009).
  11. Pozo-Rubio, T., et al. Immunostimulatory effect of faecal Bifidobacterium species of breast-fed and formula-fed infants in a peripheral blood mononuclear cell/Caco-2 co-culture system. Brit J Nutr. 106 (8), 1216-1223 (2011).
  12. Parlesak, A., Haller, D., Brinz, S., Baeuerlein, A., Bode, C. Modulation of cytokine release by differentiated CACO-2 cells in a compartmentalized coculture model with mononuclear leucocytes and nonpathogenic bacteria. Scand J Immunol. 60 (5), 477-485 (2004).
  13. Haller, D. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
  14. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  15. Morini, J., Babini, G., Barbieri, S., Baiocco, G., Ottolenghi, A. The Interplay between Radioresistant Caco-2 Cells and the Immune System Increases Epithelial Layer Permeability and Alters Signaling Protein Spectrum. Front Immunol. 8, 1-12 (2017).
  16. Dittmar, S., Harms, H., Runkler, N., Maisner, A., Kim, K. S., Schneider-Schaulies, J. Measles virus-induced block of transendothelial migration of T lymphocytes and infection-mediated virus spread across endothelial cell barriers. J Virol. 82 (22), 11273-11282 (2008).
  17. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  18. Moyes, S. M., Killick, E. M., Morris, J. F., Kadhim, M. A., Hill, M. A., Carr, K. E. Changes produced by external radiation in parameters influencing intestinal permeability and microparticle uptake in vitro. Int J Radiat Biol. 84 (6), 467-486 (2008).

Tags

Caco-2 CellsPBMCsCocultureIonizing RadiationEpithelial Cell PermeabilityTight Junction FunctionRadiation BiologyRadioimmunotherapyCell CultureDensity Gradient CentrifugationX-ray IrradiationDosimetryCell Viability

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Babini, G., Morini, J., Barbieri, S., Baiocco, G., Ivaldi, G. B., Liotta, M., Tabarelli de Fatis, P., Ottolenghi, A. A Co-culture Method to Investigate the Crosstalk Between X-ray Irradiated Caco-2 Cells and PBMC. J. Vis. Exp. (131), e56908, doi:10.3791/56908 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image