JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

שיטה תרבות משותפת לחקור Crosstalk בין רנטגן מוקרן קאקו-2 תאים, PBMC

Published: January 30, 2018
doi:
10.3791/56908
, , , , , , ,
1Dipartimento di Fisica,Università degli Studi di Pavia, 2IRCCS Istituti Clinici Scientifici Maugeri

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לחקור crosstalk בין X-ray-מוקרן קאקו-2 תאי תאי דם היקפיים (PBMC). הפרוטוקול מתחיל עם קאקו-2 הקרנה ולהגדרה של תרבות משותפת עם PBMC; לאחר מכן, ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתל נמדד באופן קבוע מעל 48 חשופה h ומערביות הופיעה קאקו-2 ו- PBMC.

Abstract

הפרוטוקול בפרשה זו עבודה שמטרתה להתיר כמה צילומי רנטגן perturb את תפקודם של המכשול מעיים, התמקדות על יחסי הגומלין בין תאים סרטניים המעי הגס ואת המערכת החיסונית. סרטן המעי הגס הוא בין הסוג הנפוץ ביותר של סרטן, מטופלים בדרך כלל על ידי ניתוח, כימותרפיה, הקרנות. יתרונות של הקרנות המיקוד הגידול ידועים היטב. אולם, אפילו מוגבל חשיפות של רקמות בריא הם דאגה גדולה, במיוחד לגבי ההשפעות על המכשול מעיים ואת המערכת החיסונית. הגדרת המאומץ מאפשר ללמוד את יחסי הגומלין בין שתי האוכלוסיות תא במצב דומה יותר האחד פיזיולוגיים, בהשוואה לתרביות תאים נורמליים. למטרה זו, אנו לנקוט טכניקות שונות, השתמשנו במבחנה תרבות משותפת מודל, המבוסס על תאים קאקו-2 הבדיל טפט, PBMC, שיתוף המדיום באותה תרבות. פרוטוקול זה פותחה כדי להתמקד על אפקטים מאקרוסקופית, קרי תא הכדאיות והן התנגדות חשמלית הטרנס-אפיתל (TEER), ו, דרך תספיג, שינוי מולקולרי, כלומר הפעלת מסלול דלקתיות ב תאים חיסוניים, הביטוי חלבון צמוד לצומת קאקו-2 תאים. ההערכה הראשונית של השפעות הקרינה על הכדאיות תא קאקו-2 הוערכה דרך 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ברומיד (MTT) מבחני Trypan blue, בעוד TEER נמדד במרווחי זמן קבועים באמצעות מד התנגדות תוכנן במיוחד עבור מערכות תרבות משותפת. בדרך זו, ניתן להדגים את ההשפעות עקב קרינה, הנוכחות של היקפי דם תאי תאים (PBMC), ובסופו של דבר, אפקט סינרגיסטי שלהם. באמצעות שיטות משלימות, הבחנו של רדיו-עמידות גבוהה של קאקו-2 בטווח של 2-10 Gy של צילומי רנטגן וחדירות טפט מוגברת של קאקו-2 כאשר נוספו PBMCs. בפרט, נוכחות PBMC נמצאה להיות מזוהה עם הוריאציה בביטוי חלבונים לגרדום צומת חזק.

Introduction

המתודולוגיה אימצה בעבודה זו תוכננה כדי לחקור את יחסי הגומלין בין תאי סרטן המעי הגס ואת המערכת החיסונית, ניצול מלכודת קרוב יותר למצב פיזיולוגי בהשוואה תרביות תאים כתרשימים רגילים.

סרטן המעי הגס (CRC) נחשב לסוג השלישי הנפוץ ביותר של סרטן, עם יותר ממיליון מקרים ברחבי העולם (המצפה סרטן העולמית, הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן, ארגון הבריאות העולמי, http://gco.iarc.fr). ניהול של CRC מתבצע באופן שגרתי באמצעות ניתוח, כימותרפיה או הקרנות1. כאשר לעומת טכניקות פולשניות כמו ניתוח או טיפול כימותרפי, הקרנות מונע בעיקר התגובות מערכתית טיפוסית מזיקה הנובעות גישות אלה קליני, הודות מסירה המותאמות לשפות אחרות של הקרינה. עם זאת, תופעות לוואי יכול להיווצר ברקמות שמסביב בריא, מפעילה דלקת עם נזק ישיר לתאים בריאים ונזק מתווכת על-ידי תופעות שאינן ממוקדות-2,–3,–4. התמקדות ההשפעות השליליות בשל ההקרנות במהלך הטיפול בסרטן המעי הגס, שני היבטים צריך להיחקר. ראשית, המנגנון האחראי של אטימות המעי יכול להשתנות על ידי משלוח הקרינה גורמת, בתורו, את האפשרות של תופעות לוואי עקב של בלימה מסולף של אוכלוסיית חיידקים, מעבר paracellular של מולקולות, מומסים בגבול. שנית, הנוכחות של רקמת הלימפה הקשורים בטן (גולט) משמש מאחז של המערכת החיסונית, עם הפונקציה של שליטה התפתחות חיידקים של מתווכים את התגובה החיסונית כללי5,6,7. כדי למלא את הפונקציות, מעיים אטימות נשמרת בשל הפונקציה של מתחמי מהחיבור בין התאים. מסיבות אלה, התוצאות מזיקה המושרה עקב מינונים שונים של צילומי רנטגן נחקרו קאקו-2 תאים לבד ובתרבויות משותף עם PBMC.

למרות מחקרים על תרביות תאים. נמצא setline הראשון של החקירה המחקר הביו-רפואי, חוסר ידע מפורט של מנגנוני נהיגה תא ביולוגיה ו הדדיים האינטראקציות בין סוגי תאים שונים עלול להיות קריטי כאשר מתקרבים בחקר הפיזיולוגיה של איברים, מערכות שההדרכה זה ניתן בקלות ליצור אותו מחדש במעבדה. לכן, החלטנו לאמץ את מלכודת תרבות משותפת, ומאפשר גם המחקר של שתי האוכלוסיות תא ביחד וגם ניתוח היבטים הקשורים ל ומנגנוני המערכת, חוץ-תאית.

תרבות משותפת היא טכניקה לנצלה כאשר הלומדים פונקציות אפיתל ואת יחסי הגומלין בין סוגי תאים שונים. בפרט, השימוש בטכניקה כזו הופך חובה במקרה שלנו, כי epithelia מורכב של תאים מאופיין קוטביות. במקרה של המכשול מעיים, enterocytes להראות קיטוב מוגדרים היטב, עם הפסגה ומופרדת basolateral הפולנים בדרך כלל בשל נוכחותם של מולקולות אדהזיה צומת-יצירת חזק. מידור זה יש צורך הפיזיולוגיה רקמות, הימנעות paracellular סחר ומאפשר המעבר של מולקולות נחוש בלבד. תכונה זו היא כמובן בלתי אפשרי לשחזר עם תאים נורמליים culturing הקמה. יתר על כן, האימוץ של הסידור תרבות משותפת מתרבה הנוכחות של תאים חיסוניים רק על פני השטח basolateral, בעוד השטח הפסגה (תואם ללומן מעיים) הוא לא ישירות עם תאים אחרים.

לאחרונה, קאקו-2 שורות תאים צברה חשיבות גדולה יותר כמודל במבחנה של מכשול המעי. למרות נגזר אדנוקרצינומה המעי הגס האנושי, קאקו-2 תאים לשמור על היכולת בידול ויצירת טפט מקוטב פונקציונלי8, אשר מאפשר החקירה של מאפייני קרום התא כאשר גדל בהוספה תרבות משותפת.

קאקו-2 culturing על קרום נקבובי הוא מודל ומבוססת במבחנה של טפט המעי, שיפור מאז תרבות משותפת בין קאקו-2 תאים אחרים. זה אומץ לעתים קרובות כדי למדוד crosstalk בין שונים תא סוגי9 והוא יכול לשמש כדי לפענח קאקו-2 מוטרד תגובה ל אקסוגניים גירויים כאשר ב תרבות משותפת, ביחס קאקו-2 תרבותי לבד.

מחקרים רבים עסקו קאקו-2 תאי תאי, להבהיר בפרט crosstalk עם המערכת החיסונית10הדם התנהגות כאשר תרבותי משותף עם שני חיידקים פתוגניים שאינם היקפיים. Pozo-רוביו. et al. 11 למד את הביטוי של ציטוקינים מספר בתרבות שיתוף קאקו-2/PBMC עם bifidobacteria מגרה קאקו-2 תאים. עבודתם מודגש השינוי ניכר לפרופילי ביטוי ציטוקינים בהתאם גירוי חיידקי שבוצעה בהעדר נוכחות/PBMC. התוצאות שלהם להוביל למסקנה כי הנוכחות של PBMC sensitizes קאקו-2 כדי bifidobacteria.

תגובות שונות של קאקו-2 תאי חיידקים פתוגניים שאינם פתוגניים להיות מוערך על ידי צוותי מחקר שונים. Parlesak et al. 12 הפגינו את ההשפעות לדיכוי המערכת החיסונית של קאקו-2 תאים על Escherichia coli-גירוי PBMC. יתר על כן, הלר ואח. 13 למד את התגובה של קאקו-2 תאים מגורה עם שני ליפופוליסכריד (LPS) enteropathogenic e. coli spp. או חיידקים שאינם enteropathogenic i.e.E. coli spp., לקטובצילוס spp., לחזק השערה כי התגובה התאים קאקו-2 אך ורק תלוי הנוכחות של לויקוציטים בקביעת תרבות משותפת.

על ידי ביצוע מבחני מעבדה משלימים שונים (למשל תספיג, ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתל, MTT, וכדומה), בנוסף הניתוח של סוגי התאים גדלו ב תרבות משותפת, המתודולוגיה כל הבטחות תוצאות יכול להיחשב נציג נוסף של מה באמת קורה בתוך vivo. יתר על כן, זה מאפשר את ההפרדה של התאים תרבות משותפת אחרת, ומאפשר לא רק לימוד סוגי תאים מעורב, אלא גם מולקולות איתות המערכת שוחרר בתוך התא העליון לעומת נמוך או בנוכחות לעומת העדר תרבות משותפת.

Protocol

להלן כללי התנהגות כרוך דם אנושי נסיגת מתנדבים בריאים. תורמים מסופקים בכתב הסכמה מדעת לפני ההרשמה. הליך זה על פי הצהרת הלסינקי, דם המשיכות בוצעו על ידי עוזרת בריאות מקצועי. 1. תא תרבות ולהגדרה תרבות משותפת שבוע לפני ההקרנות, להכין השעיה תא קאקו-2 המכילה 2.5 × 105 תאים למ”ל בינוני RPMI1640 טריים, בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 2 מ מגלוטמין, פניצילין U/mL 100 ו- 100 סטרפטומיצין μg/mL. זרע 2 מ”ל של השעיה תא בתרבות עקר 1 מיקרומטר-נקבוביות בקוטר תא שזורי. ובכן 6 צלחות ולשים את תותב לתוך צלחת 6-. טוב.הערה: תא תרבות מוסיף ייתכן שתצטרך להיות מופעל על ידי דגירה סטרילית מלאה בינונית לפני תא זריעה. במקרה זה, תרבות המדיה צריך להיות מושלך והוחלף תא ההשעיה מדיה. להוסיף 3 מ”ל של מדיום RPMI1640 טריים, בתוספת 10% FBS, 2 מ מגלוטמין, פניצילין 100 IU/mL ו- µg 100/mL סטרפטומיצין בתא התחתון בכל, התרבות התאים ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור באווירה humidified, המכילה 5% CO2. באותו יום של קאקו-2 תא הקרנה, לאסוף דם אנושי מלא זמינים מסחרית ליתיום-הפרין מצופה 6 מ ל צינורות (צינור גודל: 13 x 100 מ מ). לאחר מכן, לבודד תאי תאי דם היקפיים (PBMC) באמצעות צבע Ficoll. להיפרד PBMC, לשים 25 מ של Ficoll צינור חרוטי צנטריפוגה 50 מ ל שכבה אמצעי שווה של דם מלא מדולל 1:1 עם RPMI1640 על גבי המשטח Ficoll.הערה: תורם בריא רגיל בדרך כלל יש בערך 4-10 × 106 PBMC/mL. Centrifuge צינורות 50 מ ל- 400 גרם x במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בעדינות לאסוף את PBMC על הממשק בין Ficoll לבין פלזמה על ידי השאיפה עם פיפטה פסטר ולשים אותם צינור חרוטי 15 מ”ל. לשטוף את PBMC פעמיים על-ידי הוספת 10 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS) ואני צריך שתוציאו PBMC ב 250 x g למשך 10 דקות. תרבות PBMC לכל היותר 3-5 h ב- T25 המבחנות2 ס מ ב להשלים את התקשורת RPMI1640, כפי שתואר לפני כן, ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified, המכילה 5% CO2.הערה: לאסוף את PBMC ביום של הניסוי, זרע 2 × 106 תאים/טוב, הושעו ב- 3 מ”ל של מדיום RPMI1640 מלאה, בתא התחתון של תרבות משותפת. מוסיף עם קאקו-2 תאים מועברים בבארות המכילות PBMC 30 דקות לאחר הקרנה שלהם. PBMC שנאסף דם לא יכול להיות מתוחזק בתרבות עבור יותר מ כ 72 h, אם לא מגורה עם למשל. phytohaemagglutinin (פא), אחרי אשר הכדאיות התאים אובד.התראה: האיכות והבטיחות של כל דם ומוצרי דם יש להבטיח לאורך כל התהליך כולו. 2. הקרנה הקמה הערה: הקרנה של קאקו-2 תאים בוצעה במחלקת הקרנות של Istituto di Ricovero e Cura Maugeri ס Carattere Scientifico (IRCCS) (צרפת) עם מאיץ שימוש באופן שגרתי לטיפול בסוגי סרטן שונים. הגדר אנרגיה רנטגן פוטון 6 שיא MV. מאיץ פועלת במשטר בצים (זמן בין שני פולסים עוקבים בערך של 4 ms; משך דופק יחיד על µs 5 עם מנה לדרג עד 1 × 10-3 Gy/p). מקם את הצלחות 6-ובכן המכיל מוסיף עם קאקו-2 על המסלול של צילומי רנטגן בגיליון 1.4 ס מ בעובי פרספקס (תואם למרחק גדול מעט יותר הצטברות של הקרינה בשימוש) על 100 ס מ המקור של קרינה. במקום סם ס מ בעובי 0.5 על כל מדגם לפני ההקרנות מתרחשת כדי להבטיח את הרכיב קרינה backscattered ואיזון של חלקיקים טעונים. להאיר את התאים (מינונים בטווח של 2-10 Gy) עם פנצ’ר, סימטרי (± 2%) 20 x 20 ס מ2 קרינה בשדה ואת קצב-מנה של Gy 3/min.הערה: לשלוט “שם”-תאים לקרינה עברה באותם תנאים פרוצדורליים מאלה לקרינה, מבלי להכנס לחדר הקרנה (מנה שהתקבלו: 0 Gy).התראה: קרינה מייננת לייצור התקנים חייבים לשמש רק על ידי אנשי סגל מומחים. 3. תא הכדאיות Assay (MTT Assay) הערה: פעילות חילוף החומרים של התא קאקו-2 הוערכה באמצעות assay 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ברומיד (MTT)14. זרע 2 × 105 קאקו-2 לתוך צלחת 24-ובכן 24 שעות לפני הקרנה ב- 1.25 mL בינוני מלא. להאיר את התאים כמתואר בצעדים 2.1 2.4 ולאחר מכן דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified, המכילה 5% CO2. h 21 לאחר הקרנה, להוסיף 100 µL של 5 מ”ג/מ”ל MTT פתרון ולהשאיר את התאים ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified, המכילה 5% CO2 ב-3 שעות. למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף את התאים עם 1 מ”ל ל- PBS. להמיס את הגבישים formazan על-ידי הוספת µL 500 של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) מכל קידוח ולהעריך את ספיגת בקורא צלחת רב טוב-λ = 570 ננומטר. חזור על שלב 3.3-3.4 – 3.5-3.6-45 h לאחר הקרנה.הערה: התוצאות יוצגו כמו ההפרעות מהמצב המזויפים המתאים, אשר הוא מנורמל ל- 100%.זהירות: דימתיל סולפוקסיד היא הסוכן המתלקחת, מעצבן על העור, העיניים, מערכת הנשימה (GHS07, GHS08). במקרה של מגע עם העיניים, לשטוף מיד עם מים בשפע, פנו לטיפול רפואי. MTT הוא סוכן מעצבן על העור, העיניים, מערכת הנשימה (GHS07, GHS08). במקרה של מגע עם העיניים, לשטוף מיד עם שפע של מים, פנו לטיפול רפואי. 4. אחוזי נחישות התאים קיימא (Trypan Blue לצבוע הדרה Assay) הערה: אחוז התאים קיימא הוערכה על ידי assay Trypan Blue לצבוע הדרה. זרע 2 × 105 קאקו-2 24-ובכן צלחת 24 שעות לפני הקרנה ב- 1.25 mL בינוני מלא. להאיר את התאים עם מינונים בטווח של 0 – 10 Gy (ראה שלבים 2.1 2.4) ואז דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified, המכילה 5% CO2 24-48 שעות. לאחר שבחרת הפעם שתי נקודות, לשטוף את התאים עם PBS, למחוק אותו, ולאחר מכן להוסיף 100 µL של טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) פתרון. התאים ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified, המכילה 5% CO2 למשך 2 דקות ואז להוסיף בינוני מלא כדי לעצור את התגובה אנזימטיות. לאסוף את התאים בשפופרת 1.5 mL-centrifuge הצינור ב 500 x g עבור 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את התאים µL 50 ל- PBS. לערבב התליה תא עם 50 µL של פתרון לצבוע Trypan Blue, דגירה את התערובת למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. לספור את ויטראז’ים (כלכלית), מוכתם תאים (מעשית) עם תא Bürker. 5. טרנס-אפיתל ההתנגדות החשמלית (TEER) זרע 5 × 105 קאקו-2 תאים שבוע לפני הקרנה בצלחת 6-ובכן תרבות משותפת מוסיף (פוליאתילן terephthalate (PET), עונה 2 פרק 10-6 -נקבוביות/cm-2). h 1 לפני הקרנה, למדוד את TEER עם מד מתח/מד התנגדות. לעורר תאים כמתואר בצעדים 2.1 2.4. דגירה קאקו-2 תאים בהעדר נוכחות/תרבות משותפת עם PBMC ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified, המכילה 5% CO2. עבור הראשונה כמה שעות לאחר ההקרנות, למדוד TEER כל שעה ולאחר מכן כל 3 שעות עד 48 שעות. 6. ווסטרן כתם ניתוח של Claudin-1, Occludin, Afadin, זואי-1, זואי-2, NF-kB, XIAP זרע 5 × 105 תאים 1 שבוע לפני צילומי רנטגן חשיפה בתרבות שיתוף צלחת 6-ובכן מוסיף (PET, עונה 2 פרק 10-6 -נקבוביות/cm-2), לעורר תאים כמתואר בצעדים 2.1 2.4. דגירה קאקו-2 תאים בהעדר נוכחות/תרבות משותפת עם PBMC ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified, המכילה 5% CO2. 48 שעות לאחר הקרנה, להכין קאקו-2, PBMC lysates תא על-ידי התייחסות תאים עם פירוק התא מאגר ולאחסן דגימות ב-20 ° C.הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. לכמת את כמות החלבון הכולל בשיטה bicinchoninic חומצה (BCA).הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. מערבבים כמויות שוות של חלבונים הכולל עם מאגר מדגם Laemli נוסף עם β-mercaptoethanol (הריכוז הסופי של β-mercaptoethanol הוא 5%), מחממים את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, לסובב אותם ב 10,000 x g. דוגמאות עומס % 4-20 precast ג’ל ולבצע את אלקטרופורזה-120 V ה 1 חלבונים העברה על קרום פלואוריד (PVDF) polyvinildiene. לחסום אתרי קישור שאינם ספציפיים על-ידי המקננת PVDF ממברנה בטמפרטורת החדר עם 5% שומן חלב יבש (NFDM) ב- PBS הוסיף 0.2% Tween-20 (PBT). לשטוף את הקרום שלוש פעמים עם 10 מ”ל של 0.2% PBT במשך 5 דקות. דגירה הקרום עם עצבנות עדין לשעה בטמפרטורת החדר לפני שיוצבו בן לילה ב 4 ° C עם נוגדנים העיקריים הבאים: anti-claudin-1 אנטי-זואי-1, אנטי-זואי-2, anti-afadin, אנטי-occludin, אנטי-NF-kB, anti-XIAP, אקטין אנטי. לשטוף את הקרום שלוש פעמים עם 10 מ”ל של 0.2% PBT במשך 5 דקות. דגירה בקרום עם חזרת Peroxidase HRP מצומדת נוגדנים משניים לשעה בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין. לשטוף את הקרום שלוש פעמים עם 10 מ”ל של 0.2% PBT במשך 5 דקות. בטמפרטורת החדר, לפתח את סרטי הצילום על ידי המקננת על הממברנות עם ערכת זורח-כימותרפיה משופרת. לרכוש סרטי הצילום עם מערכת סריקה ולכמת הלהקות שהושג עם תוכנת ניתוח תמונה מתאימה.הערה: הערכת Claudin-1, Occludin, Afadin, זואי-1 ו- 2 זו מבוצעת בתאים קאקו-2. ההערכה של NF-kB, XIAP מתבצע ב- PBMC.התראה: β-mercaptoethanol הוא רעיל (GHS05, GHS06, GHS08, GHS09). לא לנשום את האדים, למנוע שחרור לסביבה וללבוש התקנים להגנה על הפרט והגנה בדרכי הנשימה. אם בלע, מיד בקשו ייעוץ רפואי. 7. ניתוח סטטיסטי כדי לקבוע אם החשיפה לקרינה ותרבות משותפת זירוז של ההפרעות סטטיסטית, לבצע בדיקה דו-כיווני השונות (ANOVA) עם השוואות מרובות עבור מדידות חוזרות ונשנות (עם Bonferroni פוסט-הוק בדיקות כדי להשוות שכפול אומר). אם צוין לא אחרת, לחשב את מובהקות סטטיסטית (p) על ידי מבחן t דו-זנבית של סטודנט. כל ערך הוא הממוצע של ± ≥ 3 ניסויים עצמאית לשגיאה הסטנדרטית של מתכוון (SEM).

Representative Results

שבוע אחד לפני הניסוי, תאים שנזרעו על גבי קרום הנקבובי של הקדמי, מותר לגדל במהלך הימים הבאים. הרמה של המפגש ניתן לבדוק באמצעות מיקרוסקופ הפוכה או דרך המדידה של ערכי TEER. ואכן, במהלך שלב הגדילה, TEER ממשיכה לגדול עד כל קרום נקבובי כבר מכוסה על ידי התאים, הם יוצרים של טפט תא הבדיל. אם התאים להתרבות מהיר/איטי, הניסוי יכול להתחיל בנקודות קודמות/מאוחר לאחר להיות נזרע. כאשר ב הנהרות, תאים ואז הביא למתקן הקרנה, למזער את imparted עקה (טמפרטורה או pH), לפני הפעלת את תרבות משותפת עם או בלי PBMC, נזרע בתא התחתון (איור 1א’), או הערכת ההתפשטות של קאקו-2 תאים. בהתחשב צפיפות זריעה הראשונית, ביום 0 תאים כדאי להגיע למפגש 100% וליצור של טפט הבדיל של תאים אפיתל, אשר יכול להיות שנצפו על ידי הרמה ב- TEER שמוצג באיור 1ב’. ברגע התאים להגיע למעמד שכזה, הערך TEER נשמרת קבועים יחסית במהלך השבוע הבא, כל עוד המדיום התרבות הישנה מוחלפת בינוני טריים, לפחות פעם בשבוע (איור 1B). כפי שמוצג באיור 1C, וזמינותו MTT אינו מציג שלשיעורים סטטיסטית של מצב proliferative קאקו-2 תאים לא-24 שעות ולא ב- 48 שעות, ללא תלות המינון שהתקבלו (עד 10 Gy). תוצאה אחרת נצפתה בנוגע התמותה לטווח קצר של קאקו-2 תאים. בשתי נקודות זמן, צביעת Trypan blue להראות עלייה למינון בתמותה התא. תוצאות אלו מראות השפעה ברורה של החשיפה לקרינה, למרות האחוזים של תאים מתים מופיעים להיות נמוך מאוד, במיוחד כאשר בוחנים כי המינון הגבוה ביותר ונמסרו (10 Gy) מייצרת רק בערך 20% של מוות תאי (איור 1D). הדגימות היו בתרבית במשותף עם או בלי PBMC בתא התחתון. בהתחשב בעובדה כי PBMC לא קיבלו כל גירוי חיצוני כדי להתרבות, ניסוי 48 שעות נחשב אידיאלי למנוע הטיה שהציג PBMC מתחיל למות. לכן, החל מיד לפני ההקרנות, TEER באופן קבוע נמדדה במשך 48 שעות, כדי לעקוב אחר תופעות אפשריות חלוף נגרם על-ידי פרוטוקול הקרנה. כפי שמוצג באיור 1 E-F, TEER הערכים מוצגים כמו וריאציות יחסית ביחס שהתנאי התייחס מראש (אשר היו מסדר 1200-1500 Ω·cm2) טוב יותר להדגיש את ההפרעות שנגזרות את ההקרנות רנטגן ו / או על-ידי הנוכחות/העדר PBMC בתרבות משותף. בשני המקרים, שיא ארעי הראשונית ניתן לראות בבירור בנקודת הזמן הראשון לאחר החשיפה לקרינה, אשר ניתן לייחס את ההליך הקרנה. כאשר לא בתרבות משותף עם PBMC (איור 1E), TEER ערכי הם כמעט קבוע למעלה עד 48 שעות, לאחר 10 Gy של צילומי רנטגן, תאים מראים ירידה ממושכת TEER שמתחילים ב- 3 שעות לאחר הקרנה. הנוכחות של PBMCs משנה לחלוטין את הדינמיקה טמפורלית TEER (איור 1F). עבור כל במינונים, ירידה TEER ברור נצפות מ-3 שעות עד כ 30 אבני שלאחר הקרנה אמיתיים, כאשר TEER מופיעה להתיישב על ערך קבוע (איור 1F). רמות הביטוי של מתחמי צמוד לצומת נחקרו ב קאקו-2 תאים lysates דרך תספיג וזמינותו. קאקו-2 תאים היו חשופים לקרינה מייננת (עם מינונים של 0, 2 ו- 10 Gy), לאחר מכן גדל לבד או בתרבות משותף עם PBMCs בתא התחתון במשך 48 שעות (כפי שמוצג באיור 2A-F). Claudin-1 ו- Occludin (איור 2א, 2 ב) נמצאו לא לשנותה באופן משמעותי על ידי צילום רנטגן ו/או תרבות משותפת עם PBMC. תנודות גדולות נצפו במקום בחלבונים לגרדום זואי-1, זואי-2 ו- Afadin (איור 2C, 2D, 2E). בפרט, צמצום רמות הביטוי של זואי-2 הוא ציין כבר אחרי 2 Gy כאשר בתרבות משותף עם PBMC רק בזמן 10 Gy כאשר קאקו-2 מגדלים לבד. רמות הביטוי Afadin במקום מושפעים רק לאחר 10 Gy של צילומי רנטגן, להפחתה נוספת כאשר קאקו-2 תרבותי משותף עם PBMCs. PBMCs תרבותי משותף עם קאקו-2 נותחו לגבי מצב דלקתי, בפרט, את גרעיני גורם שעתוק kB (NF-kB) ו X-linked המדכא של רמות החלבון (XIAP) אפופטוזיס נחקרו (איור 2 G-אני). הסכום הכולל של NF-kB לא הושפע תרבות משותפת עם קאקו-2 נחשפים מינונים שונים קרינה (איור 2G). להפך, רמות XIAP היו 4-fold up מוסדר של Gy 2 והן 10 Gy שיתוף תרבויות, למרות הווריאציות גדולים דורשים מספר גבוה יותר של דגימות ניתח להפחית תנודות כאלה ולהשיג כוח סטטיסטי יותר טוב. כפי שמוצג באיור 2F ו- 2I, יש להקות לא ספציפית עשויה להופיע לצד משקל מולקולרי הצפוי של החלבון עניין. אלא אם כן ואמיתי שאינם ספציפיים להקות בקלות ניתן להבחנה, יש לשקול נוגדנים שונים ו/או ריכוז BSA או NFDM. איור 1 . הגדרת הניסוי הכולל ואפקטים מאקרוסקופית של חשיפה לקרינה ו/או תרבות משותפת PBMC. א) תיאור סכמטי של המודל תרבות משותפת. B) TEER ערכים נמדד מדי יום מן הזרע הראשוני של קאקו-2 תאים כדי להעריך את המצב המתאים בהתפתחותם של טפט. הכדאיות תא ג) ו- D) התמותה קאקו-2 נחשף לקרינת רנטגן (Gy 0, 2, 5, 10). מידות E) TEER קאקו-2 תאים מוקרן עם 0, 2, ו-10 Gy של צילומי רנטגן תרבותי מבלי או F) עם PBMCs. כל ערך הוא הממוצע של ± ≥ 3 ניסויים עצמאית ב- SEM * p-ואל < 0.05; * * p-va l < 0.01; p-ואל < 0.001. גרפים משנת Morini et al. 15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. באיור 2. המערבי כתם התוצאות של קאקו-2 ו- PBMC lysates. רמת ביטוי של צומת חזק החלבונים (Claudin-1 (א), Occludin (B), ZO-1 (C), זואי-2 (ד) ו- Afadin (ה)) קאקו-2 לאחר 0, 2, 10 Gy של צילומי רנטגן, בהעדר נוכחות/PBMC בתרבות משותף. ערכים הם מנורמל ברמה אקטין. סרטי המחשה עבור כל צומת חזק חלבון וכל התנאים מוצגים בחלונית (נ). רמת ביטוי של NF-κB (G) ו- XIAP (H) ב- PBMCs תרבותי משותף עם קאקו-2 תאים. סרטים נציג NF-kB, XIAP של אקטין מוצגים בחלונית. כל ערך הוא הממוצע של ± ≥ 3 ניסויים עצמאית גרפים ב- SEM. מ Morini ואח. 15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

סרטן המעי הגס, עם התרחשותו גבוהה במדינות המפותחות, הוא אחד הגורמים בתדירות הגבוהה ביותר של תחלואה ותמותה באוכלוסייה. זה מנוהל בדרך כלל על ידי ניתוח, כימותרפיה, הקרנות1. במסגרת טיפולי הקרנות, יש להעניק תשומת לב מיוחדת להשפעות של רקמה בריאה חשיפה4; יתר על כן, מחקרים שיטתיים על הקשר בין חשיפה לקרינה ואת המערכת החיסונית הם היסוד לפיתוח גישות של רדיו-חיסוני3.

המתודולוגיה שאימצנו בעבודה זו יש כבר לצרכיו החקירה של קאקו-2 תאים ואת PBMC crosstalk. התמקדנו על ההשפעה של חשיפה צילומי רנטגן של תאים סרטניים, אבל באותו הפרוטוקול ניתן להתאים מחקרים עם סוכנים תרופתי. להיות קרוב יותר בתנאים פיזיולוגיים ביחס לתא רגיל culturing, היתרון חזקה של שיטה זו היא האפשרות של ניתוח מלא של מערכת מורכבת, ניתנה האפשרות של ניתוח סוגי תאים שונים והן על שחרורו של מולקולות איתות לתוך שני תאים של תרבות משותפת עצמה. בדרך זו, באופן שגרתי יישומית שיטות ביולוגי יכול לסייע להבנת הסלולר המרצד מנגנונים הקשורים.

האפיון הראשוני של X-ray הנוצרות על-ידי השפעות על תאים קאקו-2 היה מבוסס על שתי מדידות משלימות, קרי מבחן וזמינותו ערכי צבע מוחלטים MTT ומניעת Trypan צבע כחול. התוצאות ככל הנראה לא עקבי יכולה להיות מוסברת על ידי המוקד שונות של מבחני שני אלה. MTT מעריך את פעילות אנזימים oxidoreductase, ואילו Trypan צבע כחול מבוסס על מנגנון לצבוע תא חי הדרה.

החקירה של קאקו-2-PBMC הגומלין דורשת היצירה של אפיתל חד שכבתי מסוגל להוביל הפרדה מוחלטת בין שני תאים של תרבות משותפת. האפשרות של זריעה קאקו-2 תאים תותב תרבות משותפת מאפשרת את ההקרנות באוכלוסייה זו תא בלבד. מאז התרבות שיתוף מתחיל לאחר הקרנה, יש הטייה עקב כל חשיפה מקרית של PBMC. זה צריך לטפל בזהירות כדי למנוע נזק (או זיהום) טפט הסלולר במהלך התנועות של הקדמי של לוח 6-טוב אחד לשני. כאשר מבוצעת בקפידה, מדידות TEER הם שיטה לא פולשנית פשוטה לחקור את החדירות חד שכבתי. Assay זו קשורה אך ורק הסידור תרבות משותפת, וזה לא האפשרות היחידה עבור חקירת חדירות חד שכבתי. היא מאפשרת הפארמצבטית טוב של אמצעים ברגע זה טוב מכויל בינונית שלם טרי. מבחני נפוצות להתמקד פעפוע של צבעם מן התא העליון “הפסגה” התחתון “basolateral” אחד (למשל fluorescein isothiocyanate (FITC)-לתוספי assay)16. עם זאת, מאחר PBMC קיימות בתא basolateral במחקר זה, החלטנו להימנע המבוא של ריאקטיבים כימיים בניסויים.

בין הטכניקות השונות אימצו בעבודה זו, TEER מדידה הוא היחיד שדורש את הגדרת תרבות משותפת17,18. עם זאת, טכניקות מעבדה נפוצות אחרות לספק תוצאות יותר אינפורמטיבי כאשר המוחלים על תאים בתרבות המשנה, כפי שהם מאפשרים החקירה של תנאים קרוב יותר פיזיולוגית ההתקנה הנתונים יש משמעות ביולוגית חזק יותר. מצד שני, יש לציין כי השימוש של תאים גדל על תמיכה נקבובי יכול להוביל קשיים מסוימים בפעולות דרושים כדי להכין במדגמים, כגון פירוק תאים עבור הכנת תמציות תאית וינתח דרך סופג המערבי.

מערכת אימצה במחקר זה יש את הפוטנציאל להיות עוד יותר משופר, למשל עם היישום של חומרים מסוגלים לשחזר את חצרו מטריצה חוץ-תאית. עם זאת, גם לכך המורכבות מוגברת של המערכת ולאחר ניתוח מלא של הסידור יהיה קשה יותר להיות מושגת.

כיוונוני לתרבות שיתוף תא בהחלט מייצגים כלי רב עוצמה לקידום מחקרים במבחנה , להבנת מערכות מורכבות. טכניקה זו יש פוטנציאל להגדיל את הידע על מנגנונים בסיסיים, מתן חידושים ללימודי מחקר בסיסי על איתות מולקולרית, ועם היישומים האפשריים מודולציה של הפעילות של המערכת החיסונית, במסגרת ניהול מטופלים קליניים אונקולוגית.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המכון האיטלקי על פיזיקה גרעינית (INFN) יסובסד עבודה זו באמצעות הפרויקט INFN-מרידיאן. המחברים להכיר פרופסור אדוארדו Milotti (הפקולטה לפיזיקה, האוניברסיטה של טריאסטה, איטליה) לתיאום פרויקט INFN-מרידיאן; ד ר רוברטו Chignola (מחלקת ביוטכנולוגיה, האוניברסיטה של ורונה, איטליה) למתן התאים קאקו-2, מד התנגדות, ו שלו יקר עזרה והדרכה. אנו גם להכיר Agnese סולארי לקבלת סיוע טכני.

Materials

ThinCert
6 Well Cell Culture Inserts for Multiwell Plates		 Greiner Bio-one 657610 Equipment
Cell Culture Multiwell Plate, 6 Well  Greiner Bio-one 657160 Plastic
Cell Culture Multiwell Plate, 24 Well  Greiner Bio-one 662160 Plastic
RPMI 1640 without L-Glutamine Lonza 12-167F Reagents
Foetal Bovine Serum Lonza DE14-801 Reagents
L-Glutamine 200 mM Lonza 17-605C Reagents
Penicillin/Streptomycin  10K/10K Lonza 17-602E Reagents
CO2 Incubator Heal Force HF240 Equipment
Ficoll Histopaque-1077 Sigma-Aldrich 10771 Reagents
Tube, 50 mL, PP, Conical Bottom Greiner Bio-one 227261 Plastic
Tube, 15 mL, PP, Conical Bottom Greiner Bio-one 188261 Plastic
Centrifuge ThermoScientific CL31R Equipment
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P3813 Reagents
Cell Culture Flask, 25 cm2, PS Greiner Bio-one 690175 Plastic
Clinac 2100 Linear Accelerator Varian CLINAC 2100C/D Equipment
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) Sigma-Aldrich M5655 Reagents
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Reagents
Multiwell Plate Reader GDV DV990BV6 Equipment
Trypan Blue Solution 0,4 %  Amresco K940 Reagents
Trypsin-EDTA Solution Sigma-Aldrich T4049 Reagents
1.5 mL tubes Eppendorf 0030125150 Reagents
Millicell-ERS voltmeter/ohmeter Millipore MERS 00001 Equipment
Cell Lysis Buffer (10x) Cell Signalling Technology #9803 Reagents
Bürker Hemocytometer Sigma-Aldrich BR719520 Equipment
BCA Protein Quantification Kit Abcam ab102536 Reagents
2x Laemmli Sample Buffer  BioRad #1610737 Reagents
2-Mercaptoethanol  BioRad #1610710 Reagents
Accublock Digital Dry Bath Labnet International Inc. D1100 Equipment
4–20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 well, 30 µL BioRad #4568093  Reagents
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel BioRad #1658004 Equipment
PowerPac HC High-Current Power Supply BioRad #1645052  Equipment
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards BioRad #1610385  Reagents
10x Tris/Glycine/SDS Running Buffer BioRad #1610732  Reagents
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs BioRad #1704156 Reagents
Trans-Blot Turbo Transfer System BioRad #1704150 Equipment
Blotting-Grade Blocker  BioRad #1706404 Reagents
Tween-20 Sigma-Aldrich 93773 Reagents
Claudin-1 (D5H1D) XP Rabbit mAb  Cell Signalling Technology #13255 Reagents
Bovine Serum Albumine Sigma-Aldrich A7906 Reagents
ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb  Cell Signalling Technology #8193 Reagents
ZO-2 Antibody  Cell Signalling Technology #2847 Reagents
Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAb Cell Signalling Technology  #13531 Reagents
Anti-Occludin Antibody Millipore ABT146 Reagents
Anti-NF-kB p65 antibody [E379] Abcam ab32536 Reagents
Anti-XIAP antibody  Abcam ab21278 Reagents
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare Life Sciences NA931V Reagents
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare Life Sciences NA934V Reagents
Clarity Western ECL Substrate, 200 mL BioRad #1705060  Reagents
Carestream Kodak autoradiography GBX developer/replenisher Sigma-Aldrich P7042 Reagents
Carestream Kodak autoradiography GBX fixer/replenisher Sigma-Aldrich P7167 Reagents
Carestream Kodak BioMax light film Sigma-Aldrich Z370401 Reagents
Gel Doc EZ System BioRad #1708270  Equipment
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Cunningham, D., et al. Colorectal cancer. Lancet. 375 (9719), 1030-1047 (2010).
  2. Mancuso, M., et al. Oncogenic bystander radiation effects in Patched heterozygous mouse cerebellum. PNAS. 105 (34), 12445-12450 (2008).
  3. Demaria, S., Formenti, S. C. Can abscopal effects of local radiotherapy be predicted by modeling T cell trafficking. J Immunother Cancer. 4 (1), 29 (2016).
  4. Trott, K. R., et al. Biological mechanisms of normal tissue damage: Importance for the design of NTCP models. Radiother Oncol. 105 (1), 79-85 (2012).
  5. Derer, A., Deloch, L., Rubner, Y., Fietkau, R., Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy-induced immunogenic cancer cells as basis for induction of systemic anti-tumor immune responses – pre-clinical evidence and ongoing clinical applications. Front Immunol. 6, 505 (2015).
  6. Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy: The focused beam expands. Lancet Oncol. 16 (7), 742-743 (2015).
  7. Prise, K. M., O’Sullivan, J. M. Radiation-induced bystander signalling in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 9 (5), 351-360 (2009).
  8. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21 (1), 1-26 (2005).
  9. Babini, G., et al. Mechanisms of the induction of apoptosis mediated by radiation-induced cytokine release. Radiat Prot Dosim. 166 (1-4), 165-169 (2015).
  10. Pellegrina, C. D., et al. Effects of wheat germ agglutinin on human gastrointestinal epithelium: Insights from an experimental model of immune/epithelial cell interaction. Toxicol Appl Pharm. 237 (2), 146-153 (2009).
  11. Pozo-Rubio, T., et al. Immunostimulatory effect of faecal Bifidobacterium species of breast-fed and formula-fed infants in a peripheral blood mononuclear cell/Caco-2 co-culture system. Brit J Nutr. 106 (8), 1216-1223 (2011).
  12. Parlesak, A., Haller, D., Brinz, S., Baeuerlein, A., Bode, C. Modulation of cytokine release by differentiated CACO-2 cells in a compartmentalized coculture model with mononuclear leucocytes and nonpathogenic bacteria. Scand J Immunol. 60 (5), 477-485 (2004).
  13. Haller, D. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
  14. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  15. Morini, J., Babini, G., Barbieri, S., Baiocco, G., Ottolenghi, A. The Interplay between Radioresistant Caco-2 Cells and the Immune System Increases Epithelial Layer Permeability and Alters Signaling Protein Spectrum. Front Immunol. 8, 1-12 (2017).
  16. Dittmar, S., Harms, H., Runkler, N., Maisner, A., Kim, K. S., Schneider-Schaulies, J. Measles virus-induced block of transendothelial migration of T lymphocytes and infection-mediated virus spread across endothelial cell barriers. J Virol. 82 (22), 11273-11282 (2008).
  17. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  18. Moyes, S. M., Killick, E. M., Morris, J. F., Kadhim, M. A., Hill, M. A., Carr, K. E. Changes produced by external radiation in parameters influencing intestinal permeability and microparticle uptake in vitro. Int J Radiat Biol. 84 (6), 467-486 (2008).

Tags

Caco-2 CellsPBMCsCocultureIonizing RadiationEpithelial Cell PermeabilityTight Junction FunctionRadiation BiologyRadioimmunotherapyCell CultureDensity Gradient CentrifugationX-ray IrradiationDosimetryCell Viability

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Babini, G., Morini, J., Barbieri, S., Baiocco, G., Ivaldi, G. B., Liotta, M., Tabarelli de Fatis, P., Ottolenghi, A. A Co-culture Method to Investigate the Crosstalk Between X-ray Irradiated Caco-2 Cells and PBMC. J. Vis. Exp. (131), e56908, doi:10.3791/56908 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image