Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

A contribuição de um neurônio para atividade da rede é largamente determinada pela natureza dinâmica das entradas sinápticas que recebe. Tradicionalmente, o método predominante de caracterizar a atividade sináptica nos neurônios baseou-se em gravações somática célula inteira remendo-braçadeira de correntes pós-sinápticas evocadas pela estimulação elétrica de axônios de passagem. No entanto, única atividade de sinapses proximalmente localizadas com sinceridade é relatada neste caso¹. Além disso, para avaliar os mecanismos específicos de sinapse, gravações de pares de neurônios e de dendrites num local específico têm sido utilizadas para atingir as sinapses de interesse e os mecanismos de integração dendrítica, respectivamente. Um grande avanço no campo da fisiologia sináptica foi alcançado através de um casamento de técnicas ópticas e eletrofisiológicos. Laser de excitação de dois fotões microscopia (2PLSM) em combinação com a imagem latente de Ca^{2 +} e optogenetic ferramentas pode revelar detalhes tremenda da organização dinâmica da atividade sináptica em conexões neuronais específicas em fatias de cérebro em Vitro e na vivo.

Diversas vantagens feitas 2PLSM destacam-se a excitação convencional, um fóton microscopia²: (1) devido a uma natureza não-linear de dois fotões de excitação, a fluorescência é gerada apenas no volume focal, e todos os fótons emitidos representam sinais úteis (sem necessidade de pinhole); (2) comprimentos de onda, usados em 2PLSM, penetram o tecido de dispersão mais eficientemente; Além disso, dispersos fótons são demasiado diluídos para produzir a excitação de dois fotões e fluorescência de fundo; (3) Fotodano e fototoxicidade também são limitados ao plano focal. Portanto, apesar do alto custo dos sistemas 2-fóton em comparação com microscópios confocal convencionais, o 2PLSM continua a ser um método de escolha para investigação de alta resolução da estrutura neuronal e função em tecidos grossos.

A primeira aplicação de 2PLSM em tecido de dispersão foi a imagem da estrutura e função das espinhas dendríticas³. 2PLSM em combinação com Ca^{2 +} imagem latente revelou essa função de espinhos como compartimentos isolados de bioquímicos. Uma vez que em muitos tipos de neurônios, há uma correspondência exacta entre espinhos e sinapses individuais⁴, dois fotões Ca^{2 +} imagem logo tornou-se uma ferramenta útil, relatando a atividade de sinapses individuais em tecido intacto^{5, 6,7,8}. Além disso, baseada em 2PLSM Ca^{2 +} imagem foi usada com sucesso para monitorar a atividade de canais de cálcio único e as interações não-lineares entre os conductances intrínsecos e sinápticas, bem como para avaliar o estado e atividade-dependente Regulamento de Ca^{2 +} sinalização neuronal dendrites^{5,6,7,8,9,10,11}.

O cálcio é um onipresente segundo mensageiro intracelular, e sua organização spatiotemporal subcellular determina a direção de reações fisiológicas, alterações na força sináptica para a regulação do íon de canais, crescimento dos dentritos e espinha, como bem como morte celular e sobrevivência. Dendríticas Ca^{2 +} elevações ocorrem através da ativação de várias vias. Potenciais de ação (APs), backpropagating para os dendritos, abrir canais de cálcio dependentes de voltagem¹² e produzir relativamente globais transientes de Ca^{2 +} (gatos) em dendritos e espinhos¹³. Transmissão sináptica é associada com a ativação de pós-sináptica Ca^{2 +}-permeáveis receptores (NMDA, Ca^{2 +}-permeável Leandro e agonista), desencadeando sináptica gatos^6,14,15. Finalmente, supralinear Ca^{2 +} eventos podem ser gerados em dendritos sob certas condições,^11,12,13,16.

Emprega dois fotões Ca^{2 +} imagem em combinação com gravações eletrofisiológicos remendo-braçadeira sintético Ca^{2 +}-sensíveis indicadores fluorescentes, que normalmente são entregues através do eletrodo de remendo durante as gravações de células inteiras . Um método padrão para a quantificação da dinâmica de Ca^{2 +} baseia-se o método de duplo indicador^17,18. Ele usa dois fluorophores com espectros de emissão bem separados (por exemplo, uma combinação de um vermelho Ca^{2 +}-tintura insensível com verde Ca^{2 +} indicadores, tais como o Oregon Green BAPTA-1 ou Fluo-4) e tem várias vantagens quando comparado com o método do indicador único. Primeiro, uma Ca^{2 +}-tintura insensível é usado para localizar pequenas estruturas de interesse (ramificações dendríticas e espinhos) onde Ca^{2 +} imagem latente será executada. Em segundo lugar, a relação entre a mudança na fluorescência verde e vermelha (ΔG/R) é calculada como uma medida de [Ca^{2 +}], que é em grande parte insensível às mudanças na fluorescência de base devido a flutuações no [Ca^{2 +}]₀^{17 , 18}. Além disso, as alterações de fluorescência podem ser calibradas em termos de absoluta Ca^{2 +} concentrações.¹⁹.

Uma preocupação geral quando executando dois fotões Ca^{2 +} imagem experimentos em fatias agudas é celular saúde e estabilidade da aquisição imagem devido ao poder do laser alta normalmente usado. Adicionalmente, em Ca^{2 +} imagem as experiências, há preocupação com a perturbação e substancial superestimação da subcellular Ca^{2 +} dinâmica devido ao fato de que indicadores de Ca^{2 +} atuam como altamente móvel exógena Ca^{2 +} buffers. Assim, a escolha do indicador de Ca^{2 +} e sua concentração depende do tipo neuronal, a amplitude prevista de gatos e a questão experimental.

Adaptamos o método de dois fotões Ca^{2 +} imagem para investigação de Ca^{2 +} flutuações de dendrites de gabaérgica interneurônios^{9,10,11,20,21 , 22}. enquanto a maior parte do Ca^{2 +} imagem estudos iniciais foram feitos em neurônios principais, interneurônios inibitórios mostrar uma grande variedade de funcional Ca^{2 +} mecanismos que são distintos daqueles em células piramidais^{20 , 23 , 24}. estes mecanismos específicos de interneurônio (por exemplo, Ca^{2 +} permeável Leandro receptores) podem desempenhar funções específicas na regulação da atividade das células. Enquanto dendríticas Ca^{2 +} sinalização em interneurônios é um alvo tentador para maiores investigações, dois fotões Ca^{2 +} imagem em dendritos dessas células apresenta desafios adicionais, de um diâmetro mais fino de dendrites e falta de espinhos para uma particularmente elevado Ca^{2 +} ligação capacidade endógena. Como nossa pesquisa interessa foco no estudo dos interneurônios hippocampal, o seguinte protocolo, embora aplicáveis a diferentes populações neuronais, foi adaptado para lidar com esses desafios.

Este protocolo foi executado com um microscópio confocal comercial dois fotões, que foi equipado com dois detectores externos, não-descanned (NDDs), electro-ópticos modulador (Moe) e um Dodt digitalização contraste gradiente (SGC) e instalado em uma mesa de óptica. O microscópio foi acoplado com uma Ti:Sapphire do laser do multiphoton modo bloqueado a 800 nm (> 3 W, 140 pulsos fs, taxa de repetência de 80 Hz). O sistema da imagem latente foi equipado com uma plataforma padrão de eletrofisiologia, incluindo uma câmara de perfusão com controle de temperatura, uma plataforma de tradução com dois Micromanipuladores, um amplificador de microeletrodos controlado por computador, um digitador, um estímulo unidade e software de aquisição de dados.