התרומה של נוירון לפעילות הרשת נקבעת במידה רבה על ידי באופי הדינמי של הקלט סינפטית שהיא מקבלת. באופן מסורתי, השיטה הדומיננטית של אפיון פעילות סינפטיים בנוירונים הסתמך על תיקון שלם-תא הסומטית-קלאמפ הקלטות של זרמי postsynaptic עורר על ידי גירוי חשמלי של אקסונים של המעבר. עם זאת, הפעילות היחידה של הסינפסות ממוקם הציר הקרוב הוא דיווח בכנות במקרה הזה¹. בנוסף, כדי להעריך את המנגנונים הספציפיים סינפסה, שימשו הקלטות זוגות נוירונים ומן דנדריטים במיקום ספציפי למטרה הסינפסות עניין ולפי המנגנון של אינטגרציה דנדריטים, בהתאמה. פריצת דרך בתחום הפיזיולוגיה סינפטית הושג באמצעות נישואים של טכניקות אופטי אלקטרופיזיולוגיות. סריקת מיקרוסקופ (2PLSM) בשילוב עם Ca^{2 +} הדמיה וכלים optogenetic לייזר שני הפוטונים עירור עלול לחשוף פרטים עצומה של הארגון הדינאמי של פעילות סינפטית ספציפי חיבורים עצביים במוח פרוסות חוץ גופית ו ויוו.

מספר יתרונות מרכזיים שנעשו 2PLSM להתבלט מיקרוסקופ עירור קונבנציונאלי, פוטון אחד²: (1) בשל אופי לא לינארית של שני הפוטונים עירור, נוצר על ידי קרינה פלואורסצנטית רק באמצעי אחסון מוקד ולאחר כל הפוטונים הנפלטים מייצגים שימושי אותות (אין צורך חריר); (2) אורכי הגל, בשימוש 2PLSM, לחדור את הרקמה פיזור ביעילות רבה יותר; בנוסף, פוטונים מפוזר הם גם לדלל לייצר שני הפוטונים עירור, רקע זריחה; (3) נזקי phototoxicity מוגבלים גם למישור מוקד. לכן, למרות העלות הגבוהה של פוטון 2 מערכות בהשוואה מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי, נשאר 2PLSM שיטת הבחירה לחקירה ברזולוציה גבוהה של מבנה העצבית ותפקוד ברקמת החיים עבה.

היישום הראשון של 2PLSM ברקמות פיזור היתה תמונת המבנה והתפקוד של הדנדריטים³. 2PLSM בשילוב עם Ca^{2 +} הדמיה חשפה שהפונקציה קוצים כמו תאים מבודדים הביוכימי. מאז בסוגי עצביים רבים יש התאמה של אחד לאחד בין קוצים בודדים הסינפסות⁴, שני הפוטונים Ca^{2 +} הדמיה בקרוב הפך להיות כלי שימושי דיווח הפעילות של הפרט סינפסות רקמות ללא פגע^{5, 6,7,8}. יתר על כן, Ca^{2 +} דימות מבוסס 2PLSM שימש בהצלחה כדי לפקח על הפעילות של ערוצי סידן יחיד, יחסי גומלין לא לינארית conductances פנימי וסינפטית, כמו גם כדי להעריך את מצב פעילות ותלוי רגולציה של Ca^{2 +} איתות דנדריטים עצביים^{5,6,7,8,9,10,11}.

סידן הוא שליח השני תאיים בכל מקום, ייתכן האירגון subcellular קובע את הכיוון של תגובות פיזיולוגיות, מפני שינויים סינפטיים כוח ברגולציה של יון ערוצי, צמיחה דנדריט ועמוד השדרה, כמו כמו מוות של תאים, הישרדות. Ca דנדריטים^{2 +} הגבהים להתרחש באמצעות הפעלה של נתיבים מרובים. פוטנציאל פעולה (APs), backpropagating אל דנדריטים, פתיחת ערוצי סידן ממותגת מתח¹² ומפיקים יחסית הכללית Ca^{2 +} תופעות מעבר (חתולים) דנדריטים, קוצים¹³. הסינאפסית מזוהה עם ההפעלה של Ca postsynaptic^{2 +}-קולטנים חדיר (NMDA, Ca^{2 +}-חדיר אמפא, kainate), מפעילה סינפטית חתולים^14,6,15. לבסוף, ניתן להפיק supralinear Ca^{2 +} אירועים של דנדריטים תחת מסוים התנאים^11,12,13,16.

שני הפוטונים Ca^{2 +} הדמיה בשילוב עם הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תיקון-קלאמפ מעסיקה Ca סינתטי^{2 +}-אינדיקטורים פלורסנט רגיש, אשר מועברים בדרך כלל דרך האלקטרודה תיקון במהלך הקלטות שלם-תא . שיטה סטנדרטית על כימות של Ca^{2 +} דינמיקה מבוסס על כביש^17,שיטת מחוון כפול¹⁸. הוא משתמש fluorophores שני עם ספקטרום הפליטה מופרדים היטב (למשל, שילוב של אדום Ca^{2 +}-צבע אטום עם ירוק Ca^{2 +} אינדיקטורים, כגון אורגון הירוקה BAPTA-1 או Fluo-4) יש מספר יתרונות בהשוואה שיטת אינדיקציה יחידה. ראשית, Ca^{2 +}-צבע רגישות משמש כדי לאתר מבנים קטנים עניין (סניפים דנדריטי ואת עמוד השדרה) שבו יבוצעו Ca^{2 +} הדמיה. שנית, היחס בין שינוי ירוק ואדום קרינה פלואורסצנטית (ΔG/R) מחושבת כאמצעי של [Ca^{2 +}], המהווה במידה רבה רגישות לשינויים בסיסית פלורסצנטיות עקב תנודות [Ca^{2 +}]₀^{17 , 18}. יתר על כן, התפקיד פלורסצנטיות השינויים מבחינת מוחלטת Ca^{2 +} ריכוזים¹⁹.

דאגה כללית בעת הפעלת שני הפוטונים Ca^{2 +} הדמיה ניסויים בפרוסות חריפה היא בריאות ויציבות של רכישת התמונה עקב עוצמת הלייזר גבוהה משמש בדרך כלל. בנוסף, Ca^{2 +} ניסויים הדמיה, קיים חשש על ההפרעות, ניכר מופרזת של Ca subcellular^{2 +} דינמיקה בשל העובדה כי Ca^{2 +} מחוונים לשמש ניידים במיוחד אקסוגני Ca^{2 +} מאגרים. לכן, הבחירה של מחוון Ca^{2 +} והריכוז שלו תלוי על סוג עצביים, משרעת הצפויה של חתולים, השאלה ניסיוני.

שינינו את שיטת שני הפוטונים Ca^{2 +} הדמיה עבור חקירת Ca^{2 +} תנודות דנדריטים של GABAergic interneurons^{9,10,11,20,21 , 22}. בעוד עיקר מוקדם Ca^{2 +} הדמיה מחקרים נעשו בו נוירונים העיקרי, interneurons מעכבות להציג לראווה מגוון גדול של תפקודי Ca^{2 +} מנגנונים נבדלים אלה תאים כפירמידה^{20 , 23 , 24}. מנגנונים אלה interneuron ספציפיים (למשל, Ca^{2 +} חדיר אמפא רצפטורים) עשוי לשחק תפקידים ספציפיים בוויסות פעילות התאים. בעוד דנדריטים Ca^{2 +} איתות ב interneurons הוא מטרה מפתה לחקירה נוספת, שני הפוטונים Ca^{2 +} דימות in דנדריטים של תאים אלה מציגה אתגרים נוספים, מ בקוטר דק יותר של דנדריטים וחוסר קוצים כדי גבוהה במיוחד אנדוגני Ca^{2 +} מחייב קיבולת. כל תחומי המחקר שלנו המחקר של interneurons בהיפוקמפוס, פרוטוקול הבאות, בעוד החלים על אוכלוסיות עצביים שונים, הותאם להתמודד עם האתגרים הללו.

פרוטוקול זה הוצא להורג עם מיקרוסקופ שני הפוטונים מסחרי קונפוקלי, אשר מצויד עם גלאים חיצוניים, שאינם descanned שני (NDDs), אפנן אלקטרו-אופטיים (לבחירות) Dodt סריקת צבע ניגודיות (מפקדת הסטארגייט), מותקן על טבלת אופטי. המיקרוסקופ היה בשילוב עם Ti:Sapphire לייזר multiphoton במצב נעול ב 800 nm (> 3 W, 140 פעימות fs, 80 הרץ חזרה שער). מערכת ההדמייה היה מצויד מעטה אלקטרופיזיולוגיה רגיל, כולל תא זלוף עם בקרת טמפרטורה, פלטפורמה תרגום עם שני micromanipulators, מגבר microelectrode מבוקרת מחשב, של התקן דיגיטציה, גירוי היחידה, הנתונים רכישת התוכנה.