뉴런 네트워크 활동의 기여는 주로 수신 시 냅 시스 입력의 동적 특성에 의해 결정 됩니다. 전통적으로, 신경 세포에 시 냅 스 활동을 특성화의 주된 방법 postsynaptic 전류 통로의 축 삭의 전기 자극에 의해 evoked의 체세포 전체 셀 패치 클램프 기록에 의존. 그러나,이 경우¹사실 proximally 있는 시 냅 스의 유일한 활동 보고 됩니다. 또한, 시 냅 스 특정 메커니즘을 평가, 녹음 및 특정 위치에 모 수석 신경의 쌍에서 각각의 시 냅 스 및 수지상 통합의 메커니즘을 대상으로 사용 되었습니다. 시 냅 스 생리학의 분야에서 중요 한 돌파구는 광학 및 electrophysiological 기법의 결혼을 통해 달성 되었다. 2 광자 여기 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (2PLSM) Ca^{2 +} 이미징 및 optogenetic 도구와 함께 뇌 조각 에서에서 특정 신경 연결에 시 냅 시스 활동의 동적 조직의 엄청난 정보를 계시 할 수 있다 체 외 그리고 vivo에서.

몇 가지 주요 장점 만든 2PLSM 기존의 한 광자 여기 현미경²에서 밖으로 서: (1)의 2 광자 여기 비선형 특성상 형광 초점 볼륨에만 생성 되 고 모든 내보낸된 광자 대표 유용한 신호 (pinhole에 대 한 필요는 없음); (2) 긴 파장, 2PLSM, 사용 침투 분산 조직을 보다 효율적으로; 또한, 흩어져 광자는 2 광자 여기 및 배경 형광; 너무 희석 (3) photodamage 및 phototoxicity 초점 평면으로 제한 됩니다. 따라서, 기존의 confocal 현미경에 비해 2 광자 시스템의 높은 비용에도 불구 하 고는 2PLSM 신경 구조와 기능 두꺼운 살아있는 조직에서의 고해상도 조사 방법의 선택에 남아 있다.

분산 조직에서 2PLSM의 첫 번째 응용 프로그램 구조와 기능 수지상 쪽이³의 이미지를 했다. 캘리포니아^{2 +} 이미지와 함께에서 2PLSM 고립 된 생 화 확 적인 격실으로 그 쪽이 기능을 공개 했다. 두 광자 캘리포니아^{2 +} 곧 이미징 되었다 유용한 도구 그대로 조직^{5, 개별 시 냅 스의 활동을 보고 많은 신경 종류에 등뼈와 개별 시 냅 스4사이의 일대일 대응 관계입니다, 6,,78}. 또한, 2PLSM 기반 Ca^{2 +} 이미징 성공적으로 사용한 단일 칼슘 채널 및 기본 및 시 냅 스 conductances 사이 비선형 상호 작용의 활동을 모니터링 하로 평가 하는 상태 및 활동 의존 하 규칙의 캘리포니아^{2 +} 신경 dendrites^{5,6,7,8,9,,1011}에 신호.

칼슘은 유비 쿼터 스 세포내 두번째 메신저, 그리고 그것의 subcellular spatiotemporal 조직 이온의 레 귤 레이 션을 시 냅 스 강도에 따른 생리 적 반응의 방향을 결정 합니다 채널, 모 수석 등뼈 성장으로 뿐만 아니라 세포 죽음 및 생존 수지상 캘리포니아^{2 +} 고도 여러 통로의 활성화를 통해 발생합니다. 활동 전위 (APs), 모 수석에 backpropagating 전압 개폐 칼슘 채널¹² 열고 dendrites와 쪽이¹³에 상대적으로 글로벌 캘리포니아^{2 +} 과도 (고양이)를 생성 합니다. 시 냅 스 전송 postsynaptic 캘리포니아^{2 +}의 활성화와 관련 된-투과 수용 체 (NMDA, 캘리포니아^{2 +}-침투성 AMPA와 kainate),^6,,1415고양이 시 냅 스 트리거링. 마지막으로, 특정 조건^11,12,,1316에서 모 수석에 supralinear Ca^{2 +} 이벤트를 생성할 수 있습니다.

두 광자 캘리포니아^{2 +} 영상 패치 클램프 electrophysiological 녹음와 함께에서 사용 하 여 합성 캘리포니아^{2 +}-전체 셀 녹음 중 패치 전극을 통해 일반적으로 배달 민감한 형광 표시기 . 캘리포니아^{2 +} 역학의 정량화에 대 한 표준 방법 듀얼 표시기 방법^17,18을 기반으로 합니다. 두 fluorophores 잘 분리 된 방출 스펙트럼을 사용 하 여 (예를 들어, 빨간색 캘리포니아^{2 +}의 조합-녹색 Ca^{2 +} 지표, 오 레 곤 그린 BAPTA-1 또는 Fluo-4 등을 구분 하지 않는 염료)에 비해 몇 가지 장점이 고는 단일 표시 방법입니다. 첫째, 캘리포니아^{2 +}-구분 염료는 캘리포니아^{2 +} 이미징 수행할 수 관심 (수지상 지점과 쪽이)의 작은 구조를 찾는 데 사용 됩니다. 둘째, 녹색과 적색 형광 (ΔG/R)에 있는 변화 사이 비율 측정 [캘리포니아^{2 +}], [캘리포니아^{2 +}]₀¹⁷ 에서 변동으로 인해 초기 형광의 변화에 크게 민감한은으로 계산 됩니다. ^{, 18}. 또한, 형광 변경 절대 캘리포니아^{2 +} 농도¹⁹의 점에서 측정 될 수 있다.

급성 조각에서 2 광자 캘리포니아^{2 +} 이미징 실험을 실행 하는 때 일반적인 관심사 셀 건강 및 일반적으로 사용 하는 높은 레이저 전원 인해 이미지 수집의 안정성 이다. 또한, 캘리포니아^{2 +} 이미징 실험, 거기에서는 섭 동 및 subcellular 캘리포니아^{2 +} 역학의 실질적인 과대평가 대 한 우려 사실은 캘리포니아^{2 +} 지표 역할 높은 모바일 exogenous 캘리포니아^{2 +} 완충기입니다. 따라서, 실험 질문 및 신경 유형, 고양이의 예상된 진폭에 따라 Ca^{2 +} 표시기와 그것의 농도의 선택 합니다.

우리는 캘리포니아^{2 +} 변동 GABAergic 수^{9,,1011,,2021} 의 dendrites의 조사를 위해 2 광자 캘리포니아^{2 +} 이미징 방법 적응 ^{, 22}. 초기 캘리포니아^{2 +} 이미징 연구의 대량 주 신경에서 수행 했다, 금지 수 피라미드 세포²⁰ 에 그 고유 기능 캘리포니아^{2 +} 메커니즘의 큰 다양 한 쇼케이스 ^{, 23 , 24}. 이러한 interneuron 관련 메커니즘 (예:, 캘리포니아^{2 +} 침투성 AMPA 수용 체) 세포 활동을 조절에 특정 역할을 재생할 수 있습니다. 수지상 캘리포니아^{2 +} 수에서 신호는 추가 조사에 대 한 유혹 대상, 하는 동안 2 광자 캘리포니아^{2 +} 모 수석 세포 이미징 과제가 추가, 모 수석의 더 얇은 직경을 등뼈의 부족에서 특히 높은 생 캘리포니아^{2 +} 바인딩 용량. 우리의 연구 관심 hippocampal 수의 연구에 초점, 다음 프로토콜 다른 신경 인구에 적용 하는 동안 했다 그 문제를 다루는 적응.

이 프로토콜은 상업 confocal 2 광자 현미경, 2 개의 외부, descanned 비 감지기 (NDDs), 전기 광학 변조기 (엄), 및 Dodt 그라데이션 대비 (SGC), 스캔 광학 테이블에 설치는 처형 되었다. 현미경 모드 잠겨 800 Ti:Sapphire multiphoton 레이저와 결합 되었다 (> 3 W, 140 fs 펄스, 80 Hz 반복 속도) nm. 이미징 시스템 온도 제어, 2 개의 micromanipulators와 번역 플랫폼, 컴퓨터 제어 microelectrode 앰프, 디지타이저,는 자극 관류 챔버를 포함 하 여 표준 전기 생리학 장비를 장착 했다 단위, 및 데이터 수집 소프트웨어