Isolering, kultur och differentiering av benmärgens stromaceller och Osteoclast stamfäder från möss
Summary
I denna artikel presenterar vi metoder för att isolera och differentiera benmärgens stromaceller och hematopoetiska stamceller från mus långa ben. Två olika protokoll presenteras högproducerande olika cellpopulationer lämplig för expansion och differentiering till osteoblaster, adipocyter och osteoklaster.
Abstract
Benmärgens stromaceller (BMSCs) utgör en cell befolkningen rutinmässigt används som en representation av mesenkymala stamceller in vitro-. De bor i benmärgen hålrummet tillsammans med hematopoetiska stamceller (Förenta), som kan ge upphov till röda blodkroppar, immun stamfäder och osteoklaster. Således, extraktioner av cellpopulationer från benmärgen resulterar i en mycket heterogen blandning av olika cellpopulationer, som kan presentera utmaningar i experimentell design och blanda ihop tolkning av data. Flera isolering och kultur tekniker har utvecklats i laboratorier för att få mer eller mindre homogena populationer av BMSCs och Förenta invitro. Här presenterar vi två metoder för isolering av BMSCs och Förenta från mus långa ben: en metod som ger en blandad befolkning av BMSCs och Förenta och en metod som försöker separera de två cellpopulationer baserat på följsamhet. Båda metoderna ger celler passar osteogent och adipogena differentiering experiment samt som funktionella analyser.
Introduction
Primära murina BMSCs används ofta som en in vitro- modell av mesenkymala stamceller sedan sin upptäckt i början av 1980-talet1. Faktiskt, kulturer av plast-anhängare celler spolas från benmärgen hålighet i långa ben upprätthålla kapacitet att differentieras till osteoblaster, osteoklaster, kondrocyter eller adipocyter i många studier2,3, 4 , 5. benmärgen är dock en unik vävnad består av många olika cellpopulationer inklusive, men inte begränsat till, BMSCs, Förenta, endotel och immuna celler. Således, isolering och kultur tekniker kan ge cellpopulationer med olika homogenitet. Använda sådana tekniker för att testa differentieringen som potentiella från celler kan vara utmanande. Till exempel när man jämför celler från möss med olika genotyper, börjar med en blandad cell befolkningen begränsar tolkningen av data. Omvänt, att erhålla homogen populationer av BMSCs och Förenta kan vara tekniskt svårt och kanske inte så representativa av en ex vivo -modell.
I vårt laboratorium är vi främst intresserade av utilizationen av BMSCs på grund av deras potential att differentieras till osteoblaster, osteoklaster och adipocyter. Här presenterar vi tekniker för BMSCs och Förenta isolering och kultur som används för att bedöma osteoblastogenesis eller adipogenesis i vitro, såväl kulturer av Förenta differentieras till osteoklaster. En metod använder en blandad befolkning av benmärgsceller (BMC) som innehåller BMSCs och Förenta direkt lämplig för adipogenesis, osteoblastogenesis och osteoclastogenesis (kallas totala BMC). Denna metod är en närmare ex vivo representation av heterogenitet finns bland cellerna i benmärgens mikromiljö. En annan metod separerar anhängare från icke-anhängare celler i ett försök att kultur ”renare” populationer av BMSCs och Förenta (kallas anhängare BMSCs). Den sena metoden tillåter cellkulturen experiment för att starta med en mer exakt antal BMSCs eller Förenta och minskar potentialen för komplexa indirekta effekter av andra cellpopulationer som finns kvar i kulturen. Båda metoderna har tidigare publicerat och används för att behandla olika frågor6,7,8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den här artikeln presenteras två metoder för kultur av BMSCs med sina fördelar och begränsningar. Isolera cellerna kommer från benmärgen är en relativt enkel process. Att erhålla en cell befolkningen representativt av mesenkymala stamceller eller osteoklastisk föräldraparets kan dock vara utmanande på grund av den olika cellulära miljön av benmärg hålrummet.
Odling av helheten av benmärgen innehållet ger en nära representation av den i vivo mikromiljö. Ännu, iso…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1).
Materials
| 200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
| 1.5mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
| 50mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
| Dissection tools | |||
| 70μm filters | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer inverter microscope | Zeiss |
Referências
- Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
- Chen, T. L. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone. 35 (1), 83-95 (2004).
- Kokabu, S., et al. BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b. Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).
- Ghali, O., et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation. BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).
- Kretlow, J. D., et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells. BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).
- DeMambro, V. E., et al. Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss. Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).
- Maridas, D. E., et al. IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner. J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).
- Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
- Abdallah, B. M., et al. CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells. Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).
- Akiyama, K., et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension. Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).
- Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?. Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).
