Summary

Isolamento, cultura e diferenciação de células do estroma da medula óssea e osteoclasto progenitores dos ratos

Published: January 06, 2018
doi:

Summary

Neste artigo, apresentamos métodos para isolar e diferenciar as células do estroma da medula óssea e células-tronco hematopoiéticas de ossos longos de rato. Dois protocolos diferentes apresentam-se populações de células diferentes rendimento adequadas para a expansão e diferenciação em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos.

Abstract

Células do estroma da medula óssea (BMSCs) constituem uma população de células rotineiramente utilizada como uma representação de células-tronco mesenquimais in vitro. Eles residem dentro da cavidade da medula óssea, ao lado de células-tronco hematopoiéticas (linfócitos), que pode dar origem a células vermelhas do sangue, progenitores imunes e osteoclastos. Assim, extrações de populações de células resultados da medula óssea em uma mistura muito heterogénea de diferentes populações de células, que pode apresentar desafios em delineamento experimental e confundir a interpretação dos dados. Várias técnicas de cultura e isolamento foram desenvolvidas em laboratórios a fim de obter mais ou menos homogêneas populações de BMSCs e linfócitos in vitro. Aqui, apresentamos dois métodos para isolamento de BMSCs e linfócitos de ossos longos de rato: um método que produz uma população mista de BMSCs e linfócitos e um método que tenta separar as populações de duas células com base em aderência. Ambos os métodos fornecem células apropriadas para osteogênico e adipogenic diferenciação dos experimentos de ensaios, bem como funcionais.

Introduction

BMSCs murino primárias são comumente usados como um modelo in vitro de células-tronco mesenquimais, desde a sua descoberta no início dos anos 19801. Na verdade, culturas de células de plástico aderente liberadas da cavidade da medula óssea dos ossos longos mantêm a capacidade de ser diferenciadas em osteoblastos, osteoclastos, condrócitos ou adipócitos em muitos estudos2,3, 4 , 5. no entanto, a medula óssea é um tecido exclusivo composto de muitas populações de células diferentes, incluindo, mas não limitado a, BMSCs, linfócitos, células endoteliais e imunes. Assim, o isolamento e as técnicas de cultura podem render populações de células com diferente homogeneidade. Usando essas técnicas para testar a potencial de diferenciação de células pode ser um desafio. Por exemplo, ao comparar células de ratos com diferentes genótipos, começando com uma população de célula mista limita a interpretação dos dados. Inversamente, a obtenção de populações homogêneas de BMSCs e linfócitos pode ser tecnicamente difícil e pode não ser tão representativa de um modelo ex vivo .

Em nosso laboratório, nós estamos principalmente interessados na utilização de BMSCs devido ao seu potencial a ser diferenciadas em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos. Aqui, apresentamos técnicas de isolamento BMSCs e linfócitos e cultura usada para avaliar osteoblastogenesis ou adipogenesis em vitro, assim como culturas de linfócitos de se diferenciarem em osteoclastos. Um método utiliza uma população mista de células da medula óssea (BMCs) contendo BMSCs e linfócitos diretamente apropriados para adipogenesis, osteoblastogenesis e osteoclastogenesis (chamado BMCs Total). Este método é uma representação de ex vivo perto da heterogeneidade encontrada entre as células do microambiente da medula óssea. Outro método separa aderente de células não-aderentes na tentativa de populações “puras” de cultura de BMSCs e linfócitos (chamados BMSCs aderente). O método posterior permite a cultura de pilha experimentos para iniciar com um número mais exato de BMSCs ou linfócitos e reduz o potencial de complexos efeitos indiretos de outras populações de células que permanecem na cultura. Ambos os métodos foram previamente publicados e usados para tratar diferentes pesquisas perguntas6,7,8,9.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de uso para o Maine Medical Center Research Institute e institucional Cuidado Animal. 1. coleção tubos de preparação Fazer os meios de cultura BMSC, completando meio essencial mínimo α (α MEM) com 10% de soro Fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina. Coloque 100 µ l de BMSC de meios de cultura em tubos de 1,5 mL microcentrifuge. 3 ossos geralmente vão caber em um único tubo então preparar con…

Representative Results

Visão geral das culturas de célulasAs técnicas de duas cultura permitem a avaliação da diferenciação em uma população mista de BMCs composto de BMSCs e linfócitos (BMCs Total, figura 1A) ou de uma população de BMSCs separou-se linfócitos (BMSCs aderente, figura 1B). 48 horas depois que as células da medula são isoladas e chapeado (Figura 1), eles rapidamente anexar…

Discussion

Neste artigo, apresentam-se dois métodos de cultura de BMSCs com suas vantagens e limitações. Isolar as células provenientes da medula óssea é um processo relativamente fácil. No entanto, a obtenção de uma população de células representativa dos progenitores osteoclástica ou células-tronco mesenquimais pode ser um desafio devido ao ambiente celular diverso da cavidade da medula.

Cultivo a totalidade do conteúdo da medula óssea fornece uma representação perto do microambiente …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (AR061164-01A1 R01).

Materials

200μL pipet tips  Rainin 17014401
1.5mL centrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
15mL conical tube  VWR 89039-668
50mL conical tube VWR 89039-660
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Sigma-Aldrich 21-040-CM
Ethanol Fisher Science 04-355-451
Dissection tools
70μm filters BD Falcon 352350
0.25% trypsin Gibco 25200
Kimwipe VWR 82003-820
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 15710
Alkaline Phosphatase kit Sigma-Aldrich 86R
Silver Nitrate Sigma-Aldrich S6506
Sodium Thiosulfate Sigma-Aldrich S7026
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
Isopropanol Sigma-Aldrich 190764
10% Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
Whatman filter Grade 1 Sigma-Aldrich Z274852
Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit Sigma-Aldrich 387A
Glutaraldehyde Electron 16220
MEMα Gibco 12571
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
β-glycerol phosphate Sigma-Aldrich G9891
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
DMEM High Glucose  Sigma-Aldrich D5796
Rosiglitazone Cayman Chemical 717410
Insulin Sigma-Aldrich I6634
IBMX Sigma-Aldrich I5879
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
RANKL Peprotech 310-01
mCSF Peprotech 315-02
Axio Observer inverter microscope Zeiss

Referências

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Citar este artigo
Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice. J. Vis. Exp. (131), e56750, doi:10.3791/56750 (2018).

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