Isolamento, cultura e diferenciação de células do estroma da medula óssea e osteoclasto progenitores dos ratos
Summary
Neste artigo, apresentamos métodos para isolar e diferenciar as células do estroma da medula óssea e células-tronco hematopoiéticas de ossos longos de rato. Dois protocolos diferentes apresentam-se populações de células diferentes rendimento adequadas para a expansão e diferenciação em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos.
Abstract
Células do estroma da medula óssea (BMSCs) constituem uma população de células rotineiramente utilizada como uma representação de células-tronco mesenquimais in vitro. Eles residem dentro da cavidade da medula óssea, ao lado de células-tronco hematopoiéticas (linfócitos), que pode dar origem a células vermelhas do sangue, progenitores imunes e osteoclastos. Assim, extrações de populações de células resultados da medula óssea em uma mistura muito heterogénea de diferentes populações de células, que pode apresentar desafios em delineamento experimental e confundir a interpretação dos dados. Várias técnicas de cultura e isolamento foram desenvolvidas em laboratórios a fim de obter mais ou menos homogêneas populações de BMSCs e linfócitos in vitro. Aqui, apresentamos dois métodos para isolamento de BMSCs e linfócitos de ossos longos de rato: um método que produz uma população mista de BMSCs e linfócitos e um método que tenta separar as populações de duas células com base em aderência. Ambos os métodos fornecem células apropriadas para osteogênico e adipogenic diferenciação dos experimentos de ensaios, bem como funcionais.
Introduction
BMSCs murino primárias são comumente usados como um modelo in vitro de células-tronco mesenquimais, desde a sua descoberta no início dos anos 19801. Na verdade, culturas de células de plástico aderente liberadas da cavidade da medula óssea dos ossos longos mantêm a capacidade de ser diferenciadas em osteoblastos, osteoclastos, condrócitos ou adipócitos em muitos estudos2,3, 4 , 5. no entanto, a medula óssea é um tecido exclusivo composto de muitas populações de células diferentes, incluindo, mas não limitado a, BMSCs, linfócitos, células endoteliais e imunes. Assim, o isolamento e as técnicas de cultura podem render populações de células com diferente homogeneidade. Usando essas técnicas para testar a potencial de diferenciação de células pode ser um desafio. Por exemplo, ao comparar células de ratos com diferentes genótipos, começando com uma população de célula mista limita a interpretação dos dados. Inversamente, a obtenção de populações homogêneas de BMSCs e linfócitos pode ser tecnicamente difícil e pode não ser tão representativa de um modelo ex vivo .
Em nosso laboratório, nós estamos principalmente interessados na utilização de BMSCs devido ao seu potencial a ser diferenciadas em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos. Aqui, apresentamos técnicas de isolamento BMSCs e linfócitos e cultura usada para avaliar osteoblastogenesis ou adipogenesis em vitro, assim como culturas de linfócitos de se diferenciarem em osteoclastos. Um método utiliza uma população mista de células da medula óssea (BMCs) contendo BMSCs e linfócitos diretamente apropriados para adipogenesis, osteoblastogenesis e osteoclastogenesis (chamado BMCs Total). Este método é uma representação de ex vivo perto da heterogeneidade encontrada entre as células do microambiente da medula óssea. Outro método separa aderente de células não-aderentes na tentativa de populações “puras” de cultura de BMSCs e linfócitos (chamados BMSCs aderente). O método posterior permite a cultura de pilha experimentos para iniciar com um número mais exato de BMSCs ou linfócitos e reduz o potencial de complexos efeitos indiretos de outras populações de células que permanecem na cultura. Ambos os métodos foram previamente publicados e usados para tratar diferentes pesquisas perguntas6,7,8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, apresentam-se dois métodos de cultura de BMSCs com suas vantagens e limitações. Isolar as células provenientes da medula óssea é um processo relativamente fácil. No entanto, a obtenção de uma população de células representativa dos progenitores osteoclástica ou células-tronco mesenquimais pode ser um desafio devido ao ambiente celular diverso da cavidade da medula.
Cultivo a totalidade do conteúdo da medula óssea fornece uma representação perto do microambiente …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (AR061164-01A1 R01).
Materials
| 200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
| 1.5mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
| 50mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
| Dissection tools | |||
| 70μm filters | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer inverter microscope | Zeiss |
Referências
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