Summary

分離、カルチャ、および骨髄間質細胞とマウスから破骨細胞前駆細胞の分化

Published: January 06, 2018
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Summary

この記事で分離し、マウス長管骨から骨髄間質細胞と造血幹細胞を区別する手法を提案します。2 つの異なるプロトコル拡大と骨芽細胞、脂肪細胞、破骨細胞への分化誘導に適した多収の異なる細胞集団を掲載されています。

Abstract

骨髄間質細胞 (BMSCs) は、間葉系幹細胞の表現として日常的に使用されるセル人口を構成するの in vitro 。彼らは、造血幹細胞 (造血)、赤血球、免疫前駆細胞と破骨細胞に上昇を与えることができると一緒に骨髄腔内に存在します。このように、様々 な細胞の集団があり、実験的なデザインの課題を提示することができますし、データの解釈を混同の非常に混在で骨髄の結果からセル人口の抽出。いくつかの単離と培養の技術は、BMSCs と HSCs体外のもっとまたはより少なく同質な人口を得るために実験室で開発されています。ここ、BMSCs の HSCs マウス長管骨からの分離のための 2 つの方法を提案する: BMSCs の HSCs の混合された人口を生成する 1 つの方法と 2 つの細胞集団を分離しようとすると、1 つのメソッド順守に基づきます。両方の方法に適した細胞を提供する骨と脂肪細胞分化実験機能的な試金。

Introduction

1の初期の 1980年年の発見以来、プライマリ マウス BMSCs、間葉系幹細胞の in vitroモデルとして使用されます。確かに、長管骨の骨髄腔からフラッシュ プラスチック付着性細胞の培養骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、または多くの研究2,3で脂肪細胞に分化する能力を維持します。4,5します。 ただし、骨髄は、BMSCs、に限定されない、造血、内皮細胞と免疫細胞を含む多くの異なる細胞集団で構成されるユニークな組織です。したがって、分離と培養の技術は、異なる同質性を持つ細胞集団をもたらすことができます。細胞からの分化の能力をテストするようなテクニックを使用して挑戦することができます。たとえば、異なる遺伝子を持つマウスから細胞を比較すると、データの解釈に制限混合セル人口から始まります。逆に、技術的に難しいことができます BMSCs の HSCs 同種個体群を取得し、代表できない場合があります前のヴィヴォモデルの。

当研究室で主に脂肪細胞、破骨細胞、骨芽細胞に分化する潜在性のため BMSCs の活用に興味を持っております。ここでは、BMSCs と HSCs の分離、osteoblastogenesis または脂肪細胞形成の in vitro評価するために使用されるカルチャのテクニックだけでなく、破骨細胞に分化する造血の文化を提案します。1 つの方法は、BMSCs と脂肪細胞形成、osteoblastogenesis、破骨細胞形成 (合計 Bmc と呼ばれる) に直接適して HSCs を含む骨髄細胞 (Bmc) の混合された人口を使用します。このメソッドは、不均一性骨髄微小環境の細胞の中で見つかった前のヴィヴォ近い表現です。別の方法は、BMSCs と (呼ばれる付着 BMSCs) HSCs の文化「純粋な」集団にしようとの付着性の非付着性のセルからを分離します。以降のメソッドを使用する細胞培養 BMSCs または HSCs のより正確な数を開始する実験し、文化に残る他の細胞の複雑な間接効果の可能性が低くなります。両方の方法は以前発行し、さまざまな研究の質問6,7,8,9に対処するために使用します。

Protocol

すべての実験手順は、機関動物ケアとメイン州医療センター研究所利用委員会によって承認されました。 1. 管の準備 10% 牛胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシンの 1% 最小値必要な媒体 α (MEM α) を補うことでボーマン培地を作る。 1.5 mL 遠心チューブにボーマン文化メディアの 100 μ L を配置します。3 骨は、単管はそうそれに応じて準備に通常収まり?…

Representative Results

細胞培養の概要2 つのカルチャの技術は、BMSCs と造血 (合計 Bmc、図 1 a) から成る Bmc の混合された人口または人口 BMSCs の分化の評価は HSCs (付着 BMSCs、図 1 b) から分割を許可します。骨の髄からセルを分離して (図 1) をメッキ後の 48 時間は、彼らは急速にプラスチック培養プレートの下…

Discussion

この記事で BMSCs の文化の 2 つの方法は、それぞれの利点と制限が表示されます。骨の髄から来る細胞を分離することは、比較的楽なプロセスです。ただし、間葉系幹細胞や破骨細胞前駆細胞の代表的な細胞集団を取得骨髄腔の多様な細胞内環境のために挑戦することができます。

骨髄内容の全体を養殖生体内微小環境の状態を提供します。まだ、非常に異なる数?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、健康の国民の協会 (R01 AR061164 01A1) によって支えられました。

Materials

200μL pipet tips  Rainin 17014401
1.5mL centrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
15mL conical tube  VWR 89039-668
50mL conical tube VWR 89039-660
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Sigma-Aldrich 21-040-CM
Ethanol Fisher Science 04-355-451
Dissection tools
70μm filters BD Falcon 352350
0.25% trypsin Gibco 25200
Kimwipe VWR 82003-820
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 15710
Alkaline Phosphatase kit Sigma-Aldrich 86R
Silver Nitrate Sigma-Aldrich S6506
Sodium Thiosulfate Sigma-Aldrich S7026
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
Isopropanol Sigma-Aldrich 190764
10% Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
Whatman filter Grade 1 Sigma-Aldrich Z274852
Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit Sigma-Aldrich 387A
Glutaraldehyde Electron 16220
MEMα Gibco 12571
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
β-glycerol phosphate Sigma-Aldrich G9891
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
DMEM High Glucose  Sigma-Aldrich D5796
Rosiglitazone Cayman Chemical 717410
Insulin Sigma-Aldrich I6634
IBMX Sigma-Aldrich I5879
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
RANKL Peprotech 310-01
mCSF Peprotech 315-02
Axio Observer inverter microscope Zeiss

Referências

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Citar este artigo
Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice. J. Vis. Exp. (131), e56750, doi:10.3791/56750 (2018).

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