अलगाव, संस्कृति, और चूहों से अस्थि मज्जा Stromal कोशिकाओं और अस्थिशोषक Progenitors के भेदभाव
Summary
इस अनुच्छेद में, हम वर्तमान तरीकों को अलग करने और हड्डी मज्जा stromal कोशिकाओं और टेम माउस लंबी हड्डियों से स्टेम कोशिकाओं अंतर । दो अलग प्रोटोकॉल अलग कोशिका osteoblasts, adipocytes, और osteoclasts में विस्तार और भेदभाव के लिए उपयुक्त आबादी उपज प्रस्तुत कर रहे हैं ।
Abstract
अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं (BMSCs) नियमित रूप से mesenchymal स्टेम सेल के एक प्रतिनिधित्व के रूप में इस्तेमाल किया एक सेल जनसंख्या का गठन इन विट्रो । वे टेम स्टेम सेल (HSCs), जो लाल रक्त कोशिकाओं को जंम दे सकता है के साथ अस्थि मज्जा गुहा के भीतर रहते हैं, प्रतिरक्षा progenitors, और osteoclasts । इस प्रकार, विभिंन कोशिका आबादी का एक बहुत विषम मिश्रण में अस्थि मज्जा परिणामों से कोशिका की आबादी के निष्कर्षण, प्रयोगात्मक डिजाइन में चुनौतियों का सामना कर सकते है और डेटा व्याख्या पाया । कई अलगाव और संस्कृति तकनीक प्रयोगशालाओं में विकसित किया गया है क्रम में BMSCs और HSCs इन विट्रोके अधिक या कम सजातीय आबादी प्राप्त करने के लिए । यहां, हम BMSCs और HSCs के अलगाव के लिए माउस लंबी हड्डियों से दो तरीके: एक तरीका है कि पैदावार BMSCs और HSCs की एक मिश्रित जनसंख्या और एक विधि है कि दो कोशिका पालन के आधार पर आबादी अलग करने का प्रयास मौजूद हैं । दोनों तरीकों osteogenic और adipogenic भेदभाव प्रयोगों के साथ ही कार्यात्मक परख के लिए उपयुक्त कोशिकाओं प्रदान करते हैं ।
Introduction
प्राथमिक murine BMSCs सामांयतः mesenchymal स्टेम सेल के इन विट्रो मॉडल के रूप में 1980 के दशक के शुरू में अपनी खोज के बाद से1इस्तेमाल कर रहे हैं । वास्तव में, प्लास्टिक की संस्कृतियों-अनुयाई लंबी हड्डियों के अस्थि मज्जा गुहा से फ्लश की क्षमता बनाए रखने के कई अध्ययनों में osteoblasts, osteoclasts, chondrocytes, या adipocytes में अंतर किया जा2,3, 4 , 5. हालांकि, अस्थि मज्जा एक अद्वितीय सहित कई अलग सेल आबादी से बना ऊतक है, लेकिन सीमित करने के लिए, BMSCs, HSCs, endothelial, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं. इस प्रकार, अलगाव और संस्कृति तकनीक अलग सजातीयता के साथ सेल आबादी उपज कर सकते हैं । ऐसी तकनीक का प्रयोग कोशिकाओं से भेदभाव की क्षमता का परीक्षण करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है । उदाहरण के लिए, जब विभिंन पादी के साथ चूहों से कोशिकाओं की तुलना, एक मिश्रित सेल जनसंख्या के साथ शुरू डेटा की व्याख्या सीमा । इसके विपरीत, BMSCs और HSCs की समरूप आबादी प्राप्त करना तकनीकी रूप से मुश्किल हो सकता है और एक पूर्व वीवो मॉडल के प्रतिनिधि के रूप में नहीं हो सकता है ।
हमारी प्रयोगशाला में, हम मुख्य रूप से BMSCs के उपयोग में उनकी क्षमता के कारण osteoblasts, osteoclasts, और adipocytes में विभेदित होने में रुचि रखते हैं । यहां, हम BMSCs और HSCs अलगाव और संस्कृति की तकनीक वर्तमान osteoblastogenesis या इन विट्रो मेंadipogenesis का आकलन करते थे, साथ ही HSCs की संस्कृतियों osteoclasts में अंतर करने के लिए । एक विधि अस्थि मज्जा कोशिकाओं (BMCs) युक्त BMSCs और HSCs सीधे adipogenesis, osteoblastogenesis, और osteoclastogenesis के लिए उपयुक्त की एक मिश्रित जनसंख्या का उपयोग करता है (कुल BMCs कहा जाता है) । इस विधि अस्थि मज्जा microenvironment की कोशिकाओं के बीच पाया विविधता के एक करीब पूर्व vivo प्रतिनिधित्व है । एक अंय विधि गैर से अनुयाई अलग-अनुयाई कोशिकाओं को संस्कृति के प्रयास में “purer” BMSCs और HSCs की आबादी (अनुयाई BMSCs कहा जाता है) । बाद में विधि सेल संस्कृति प्रयोगों BMSCs या HSCs की एक और अधिक सटीक संख्या के साथ शुरू करने के लिए अनुमति देता है और अन्य कोशिका आबादी है कि संस्कृति में रहने के जटिल अप्रत्यक्ष प्रभाव की क्षमता को कम करता है. दोनों तरीकों को पहले से प्रकाशित किया गया है और विभिंन अनुसंधान प्रश्न6,7,8,9पता इस्तेमाल किया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अनुच्छेद में, BMSCs की संस्कृति के दो तरीकों उनके फायदे और सीमाओं के साथ प्रस्तुत कर रहे हैं । अस्थि मज्जा से आ रहा अलग कोशिकाओं को एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया है. हालांकि, mesenchymal स्टेम कोशिकाओं या osteoclastic progenito…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01 AR061164-01A1) ने समर्थन दिया था.
Materials
| 200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
| 1.5mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
| 50mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
| Dissection tools | |||
| 70μm filters | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer inverter microscope | Zeiss |
Referências
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