בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים
Summary
במאמר זה, נציג שיטות כדי לבודד, להבדיל תאי סטרומה מח עצם של תאי גזע hematopoietic עצמות ארוכות העכבר. שני פרוטוקולים שונים מוצגים מניב אוכלוסיות תאים שונים עבור הרחבת ובידול לתוך תאי העצם, adipocytes ו osteoclasts.
Abstract
מח עצם סטרומה תאים (BMSCs) מהווים אוכלוסיה תא בשימוש שגרתי כייצוג של גזע mesenchymal אין ויטרו. הם מתגוררים בתוך החלל מח העצם לצד hematopoietic תאי גזע (HSCs), אשר יכולים להצמיח תאי דם אדומים, מחוסן. אבות ו osteoclasts. לפיכך, עקירות של אוכלוסיות תאים מתוצאות מח עצם תערובת הטרוגנית מאוד של אוכלוסיות תאים שונים, אשר ניתן להציג את האתגרים בעיצוב ניסיוני, וחיסול פרשנות הנתונים. מספר בידוד וטכניקות תרבות פותחו במעבדות כדי לקבל אוכלוסיות פחות או יותר הומוגנית של BMSCs ו- HSCs invitro. כאן, אנו מציגים שתי שיטות בידוד של BMSCs ו- HSCs של עצמות ארוכות העכבר: שיטה אחת המניבה אוכלוסייה מעורבת של BMSCs ו- HSCs ובשיטת אחד שמנסה להפריד בין האוכלוסיות תא שני המבוסס על הדבקות. שתי השיטות מספקות תאים מתאים osteogenic ו- adipogenic בידול ניסויים מבחני גם פונקציונלית.
Introduction
BMSCs מאתר ראשי משמשות כמודל במבחנה של גזע mesenchymal מאז גילוין בתחילת שנות השמונים1. אכן, תרביות של תאים פלסטיק-חסיד מבניין את חלל מוח העצם של עצמות ארוכות לשמר את היכולת להיות מבודלים לתוך תאי העצם, osteoclasts, chondrocytes או adipocytes הרבה מחקרים2,3, 4 , 5. עם זאת, מח העצם היא רקמה ייחודית המורכבת רבים אוכלוסיות תאים שונים, לרבות אך לא מוגבל, BMSCs, HSCs, תאי אנדותל, ואת המערכת החיסונית. לפיכך, בידוד וטכניקות תרבות יכולות להניב תא אוכלוסיות בעלות הומוגניות שונות. שימוש בטכניקות כאלה כדי לבדוק את הבידול פוטנציאליים מתאי יכול להיות מאתגר. לדוגמה, בעת השוואה בין תאים של עכברים עם אחרים שונים, החל עם אוכלוסיה לתא מעורב מגביל את הפרשנות של הנתונים. לעומת זאת, קבלת אוכלוסיות הומוגנית של BMSCs ו- HSCs יכול להיות מבחינה טכנית קשה ולא ניתן גם נציג של דגם ex-vivo .
במעבדה שלנו, אנו מעוניינים בעיקר הניצול של BMSCs בשל הפוטנציאל שלהם כדי להיות מבודלים לתוך תאי העצם, osteoclasts ו- adipocytes. כאן, אנו מציגים שיטות בידוד BMSCs ו- HSCs והתרבות להערכת osteoblastogenesis או adipogenesis במבחנה, כמו גם תרבויות HSCs כדי להתמיין osteoclasts. שיטה אחת משתמשת אוכלוסייה מעורבת של תאים במח העצם (BMCs) המכילה BMSCs ו HSCs ישירות מתאים adipogenesis, osteoblastogenesis, osteoclastogenesis (נקרא BMCs סה כ). שיטה זו היא קרובה יותר ex-vivo ייצוג של הטרוגניות מצא בין התאים של microenvironment מח העצם. שיטה נוספת מפרידה מחסידי מתאי שאינו חסיד, בניסיון אוכלוסיות “מזוכך” תרבות של BMSCs ו- HSCs (נקרא חסיד BMSCs). שיטת מאוחר יותר מאפשרת התרבות התא ניסויים כדי להתחיל עם מספר מדויק יותר של BMSCs או HSCs ומפחית את הפוטנציאל של מורכבות השפעות עקיפות של אוכלוסיות אחרות-תא שנותרו בתרבות. שתי השיטות יש כבר בעבר לאור ולא להשתמש בו כדי לטפל מחקריות שונות שאלות6,7,8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, שתי שיטות של התרבות של BMSCs מוצגים עם המגבלות והיתרונות שלהן. בידוד תאים מגיע ממח העצם הוא תהליך יחסית ללא מאמץ. עם זאת, קבלת אוכלוסיה תא נציג של גזע mesenchymal או אבות osteoclastic יכול להיות מאתגר בשל הסביבה התאית מגוונות של חלל מח.
Culturing מכלול של התכנים מח עצם מספק ייצוג קרוב ש…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R01 AR061164-01A1).
Materials
| 200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
| 1.5mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
| 50mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
| Dissection tools | |||
| 70μm filters | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer inverter microscope | Zeiss |
Referências
- Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
- Chen, T. L. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone. 35 (1), 83-95 (2004).
- Kokabu, S., et al. BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b. Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).
- Ghali, O., et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation. BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).
- Kretlow, J. D., et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells. BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).
- DeMambro, V. E., et al. Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss. Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).
- Maridas, D. E., et al. IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner. J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).
- Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
- Abdallah, B. M., et al. CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells. Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).
- Akiyama, K., et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension. Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).
- Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?. Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).
