Вызывая Cre-lox рекомбинации в мыши головного мозга путем электропорации в утробе матери

Создание генетических мозаика — классический экспериментальная парадигма для понимания функции гена интереса. Чтобы определить, является ли необходимой для клеточном фенотипу ген, простейший подход вызывает потерю функции гена во всем организме (например , нокаут). Однако чтобы определить, если ген требуется конкретно определенного типа клеток, нокаут гена во всем организме не является допустимым подход. Вместо этого метода не требуется, приведет к потере функции гена в данной ячейке, в то время как он окружен ткани wildtype (т.е. генетически невозмущенной) — другими словами, создание мозаики тканей. Если мутант ячейки показывает мутант фенотип, но окружающие клетки wildtype, не гена функции клеток автономные образом. Анализ мозаика ткани, в которой мутантные клетки окружены wildtype ткани, идеально подходит для понимания клеток автономных функций генов, особенно в головном мозге, где нейронов и глии образуют обширную сеть взаимосвязанных ткани.

Несколько видов ткани мозга мозаики предоставляют мощные модели для изучения клеток автономных функций генов. Исследования были посвящены нейрональных трансплантации¹, женский Х-хромосомой мозаичностью^2,3,4, и эндогенного соматических мозаичностью^5,6 нарисовали их выводы, основанные на мозаика ткани мозга. Условного удаления гена через систему Cre-lox рекомбинации является метод, который принимает полное преимущество большой доступности трансгенные мыши линий. В этом методе два loxP сайты появляются по обе стороны требуемую последовательность гена (например экзона), оставляя его в окружении loxP сайты, что оба лицом в одном направлении («floxed»). CRE рекомбиназа акцизов последовательности между сайты loxP⁷. CRE опосредованной рекомбинации можно достичь путем скрещивания floxed мышей к другой мыши линии, выражая Cre рекомбиназа наряду с флуоресцентные маркер в подмножество ячеек («Cre репортер линия»). Это было продемонстрировано в различных способов, чтобы раскрыть функции гена в подмножества ячеек, например возбуждающих нейронов или астроциты⁸. CRE репортер линии можно выразить CreER^T2 разрешить Cre опосредованной рекомбинации быть наркотиков индуцибельной (сингл нейрон маркировки с индуцибельной Cre опосредованной нокаутом, или пятно)⁹. В другой стратегии под названием Мозаика анализ с маркерами (MADM)^10,11КРР опосредованной interchromosomal Рекомбинация позволяет гомозиготных мутанта созданы наряду с гетерозиготной ткани. В этих подходов новая линия мышей должна производиться каждый раз для каждого кандидата ген или сотовой подтип, для которого проверяется. Кроме того рекомбиназа Cre могут быть введены постнатально через ионофорез¹² или вирусных векторов (например аденоассоциированный вирусов¹³ или lentiviruses¹⁴ ношение сотовых подтип конкретных промоутеры). Эта стратегия создает сильный и послеродовой маркировки. Ориентироваться на развитие мозга корковых нейронов малонаселенных и пренатально, идеальной стратегии находится в утробе матери электропорации Cre рекомбиназа с маркером флуоресцентные.

Кроме объединения Cre-lox рекомбинации через в утробе матери электропорации производить мозаика ткани в естественных условиях, мы представляем несколько адаптации процедур из других опубликованных протоколов^{15,,16 17,18,19,,2021}. Мы предоставляем информацию для улучшения успех размножения приурочен беременных самок. Мы также приводим наши две стратегии ввести разреженных и яркие маркировки нейронов коркового ткани: одна стратегия заключается в том, чтобы Титруйте уровни одной конструкции кодирования для рекомбиназа КРР и флуоресцентных маркеров²². Другая стратегия заключается в использовании системы «Supernova», разработанный специально с этими параметрами в виду^23,24. Кроме того мы предлагаем улучшений на производстве последовательной микроинъекции пипетки и упрощения для хирургии электропорации в утробе матери . Наконец мы наметим важнейшие шаги в упрощенной гистологический препарат, который позволяет анализ дендритных шипиков и дендритных и аксональной беседок, без дальнейшего окрашивания или иммуногистохимия.