Chronische Transkraniellen Elektrostimulation und Intracortical Aufnahme bei Ratten

Transkraniellen Elektrostimulation (TES) ist eine wertvolle methodische Aktivität des Gehirns in eine zeitlich beschränkte Weise beeinflussen. Je nach Größe und Platzierung der Elektroden Stimulation, TES beeinträchtigen großes Gehirn Volumen und mitzureißen neuronale Populationen diffus^1,2,3. Transkranielle Gleichstrom Stimulation ist für die Behandlung von schweren depressiven Störungen^4,5, und viele Studien zu konzentrieren auf die kognitive Effekte der transkraniellen Stimulation in Menschen⁶ zeigen bereits medizinisch anerkannt. ^{, 7}. Darüber hinaus viel versprechende Ergebnisse wurden bei der Kontrolle der epileptische Anfälle^8,9der Potenziale der TES gemeldet.

Trotz intensiver Forschung gibt es noch viele offene Fragen hinsichtlich der genaue Mechanismus der Action, mögliche Nebenwirkungen und das langfristige Resultat der Anwendung dieser Methode^10,11,12. Daher ist es von entscheidender Bedeutung für eine stabile und reproduzierbare Protokoll, die Auswirkungen des TES in Tiermodellen zu untersuchen haben. Angesichts der Tatsache, dass viele Erkrankungen (z.B.Depressionen, Epilepsie und Schizophrenie) nur ausgiebig werden wach Tiere untersucht können und die Natur von diesen Erkrankungen erfordern in der Regel langfristige Behandlung, bieten wir ein Protokoll für chronische Implantation von Elektroden Transkranielle bei Ratten. Die hier vorgestellte Methode eignet sich für Verhaltensstudien oder kombinierbar mit Implantation von Elektroden Aufnahme (d.h., Kabel, Silikon-Sonden, Juxtacellular Elektroden) oder chronische kranialen Windows für elektrophysiologische Experimente und bildgebenden Verfahren, beziehungsweise. Abhängig von den experimentellen Design kann das Timing der Stimuli zufällige oder ereignisgesteuerte spezifischen Verhaltens Hinweise oder die elektrophysiologischen Markenzeichen von bestimmten Gehirn Staaten (Anfälle, Theta-Schwingungen)^{8, 11 , 13}.

Es ist wichtig zu erwähnen, dass im Gegensatz zu den derzeit verwendeten menschlichen Ansatz, der Verkörperung der Elektroden auf der Haut verwendet werden, hier eine Methode zeigen wir, die subkutane Implantation rechts über die Oberfläche des Schläfenbeins, da Ratten kaum beschäftigt tolerieren Sie nichts auf ihrer Haut, die leicht zu erreichen mit ihren Pfoten gelegt.

Nach den Grundsätzen der Ersatz, Reduktion und Raffinesse, aufgrund der chronischen Natur der Implantation hilft diese Methode zur Reduzierung der Anzahl der Tiere, da jedes Tier in verschiedenen experimentellen Bedingungen monatelang, erlaubt die Verwendung eingestellt werden kann weniger Tiere zu verschiedenen Hypothesen zu testen.

In der vorliegenden Studie wir bieten eine ausführliche, schrittweise Protokoll Transkranielle Stimulation Elektrode Herstellung (Abbildung 1A-B) und zeigen die chronische Implantation diese Elektroden über die zeitliche Knochen ein sechs-Monat-alten männliche Long-Evans-Ratte.

Alle hier beschriebene Methoden sind nach den Richtlinien der Europäischen Gemeinschaften Rat (86/609 ECC) und für Animal Research bei Albert Szent-Györgyi medizinische und pharmazeutische Center der Universität von der Ethikkommission genehmigt worden Szeged (XIV/218/2016).

1. Herstellung der Elektroden Stimulation

1. Zu einer Stimulation Elektrode, schneiden sechs 10 cm lange Stücke von Miniatur-Anschluss Drähte entfernen 2 cm von der Verkleidung an einem Ende und 1 cm am anderen Ende.
2. Zwei Kabel Verdrillen und kürzere geschälte seitlich festlöten.
3. Erwerben Sie einen Streifen von drei Band-Verpackung einer integrierten Schaltung mit SOT-353-Fall.
4. Nähen Sie die verdrillten Leitungen durch die drei Löcher des Pakets. Mehr geschälte Segment der Drähte sollte sich in den Hohlräumen des Pakets. Positionieren Sie die Kabel so, dass das Ende der Isolierung im Einklang mit den Rand der Löcher ist.
5. Setzen Sie den dental Zement auf den Löchern, die Drähte zu beheben.
   Achtung: Der dental Zement muss dicht genug, um zu vermeiden, in den Hohlraum des Pakets undicht sein.
6. Sobald der Zement verfestigt (mindestens 10 min) ist, drehen Sie das Paket und legte eine dünne Schicht von Sekundenkleber in das Loch eine Wasserdichte Abdichtung gegenüber den porösen Zement zu bilden. Zu vermeiden, kleben die geschälte Drähte.
7. Verdrillen Sie die Kabel auf der kürzeren Seite geschälte und festlöten Sie (Abbildung 1A).
8. Greifen Sie mehr geschälte Segment der Drähte mit der Spitze eines feinen Pinzette zu, Rollen sie herum zu und wickeln Sie sie in die Hohlräume (Abbildung 1 b). Schneiden Sie überschüssiges Kabel, wenn nötig.

2. Herstellung der Aufnahme Elektroden

1. Um eine Aufnahme zu machen sah Triplett Elektrode (Abbildung 1-D), schneiden Sie ein 1 cm langes Stück Edelstahlrohr mit High-Speed-Rotary. Entfernen Sie die Flosse von den Enden des Rohres mit einer spitzen Nadel zu und dafür sorgen Sie, dass das Rohr frei von Schmutz und völlig durchlässig ist.
   Hinweis: Verwenden Sie Zange, nicht, wie sie das Rohr verzieht.
2. Biegen Sie eine vergoldete Board Abstandhalter Pin mit einer Mindestlänge von 3 cm, Inhaber eines J-Form zu bilden. Schneiden Sie das längere Bein der 'J' Form und Löten sie zusammen, um wieder die ursprüngliche Form, eine abnehmbare Gelenk zwischen der langen linearen Teil, der von dem stereotaktischen Gerät stattfinden wird, und die "U"-Form, die die Elektrode zu halten, und dienen als ein Ankerpunkt zu machen . Das Rohr und das kürzere Bein des Inhabers "J" zusammenkleben. Kleben Sie einige zusätzliche 1 cm langen Stangen, falls erforderlich, für die Stabilität.
3. Schneiden Sie 3 Stücke von 2,5 cm lange elektrodenleitungen mit Edelstahl, ultrafeine Schere. Stellen Sie sicher, dass es einen klaren und scharfen Schnitt, und die Isolierung an der runden Oberfläche der Elektrode Leitung intakt ist. Stellen Sie außerdem sicher, dass der Schnitte Tipp nicht aufgrund der Krafteinwirkung gebogen ist. Beugen Sie 1 oder 2 mm an einem Ende der einzelnen Drähte in verschiedenen Winkeln (z.B., eine linke gerade eine 45 ° und einen rechten Winkel), unterscheidbar zu machen.
4. Das Rohr mit den Drähten zu füllen, wählen Sie einen entsprechenden Abstand der Elektroden für das Experiment (z. B.zur kortikalen lokales Feld möglicher (LFP) und aktuelle Quelle Dichte (CSD) Registrierung der empfohlenen Vorsprung von den Spitzen der Drähte aus der Öffnen der Tube: 4,5 mm, 4,1 mm und 3,7 mm, beziehungsweise). Hinweis, welcher Draht welche Tiefe für die Aufrechterhaltung einer richtigen Kanal Ordnung entspricht.
5. Sobald die Drähte neben einander rechtsbündig und sind parallel mit dem Rohr, zur Behebung der elektrodenleitungen platzieren Sie einen einzigen Tropfen flüssigen Sekundenkleber an beiden Enden des Rohres mit einer spitzen Nadel. Stellen Sie sicher, dass der Kleber in das Rohr durch die Kapillarwirkung, aber nicht in der Aufnahme-Standorte an den überstehenden enden fließt.
6. Bereiten Sie eine Elektrode-Interface-Platine mit einem richtigen Microconnector kompatibel mit dem Aufnahmesystem verwendet werden.
7. Führen Sie die nicht-Aufnahme, gebogenen Enden der Drähte in die Löcher der Elektrode Interface-Platine entsprechend des gewünschten Aufnahme Kanals ein. Wenn alle Drähte in Position sind, drücken Sie die gold Pins in die Löcher mit einer Pinzette.
   Hinweis: Gold Pins können mit dental Zement fixiert werden, aber in den meisten Fällen ist es stabil genug, auch ohne diese Sicherheit Schritt.

3. Anästhesie

1. Legen Sie das Tier in einer versiegelten Anästhesie Induktion Kammer und mit 4-5 % von Isofluran in 2 L/min medizinische Luft füllen.
2. Wenn die Ratte Liegerad ist, entfernen Sie das Tier aus der Kammer zu und legen Sie sie in einem stereotaktischen Rahmen mit eine geeignete Belüftung Nasenstück.
3. Stellen Sie Isofluran auf 2 % ein, obwohl die Rate der Luftstrom sollte gleich bleiben. Überprüfen Sie die Höhe der Anästhesie. Ist die Abwesenheit von der Pfote Rückzug Reflex in Reaktion auf kneifen, weiter, sonst erhöhen die Tiefe der Narkose.
4. Überwachen Sie und warten Sie die Ratte Körpertemperatur auf 37 ± 0,5 ° C mit einem homöotherm Überwachungssystem. Wenden Sie ein Tröpfchen von Paraffin-Salbe auf die Augen, Austrocknung der Hornhaut zu verhindern. Wiederholen Sie diesen Vorgang während der Operation mehrmals, wenn nötig.
5. Subkutan injizieren Sie 0,3 mg/kg Atropin um Schleim in den Atemwegen zu vermeiden. Wiederholen Sie diesen Vorgang alle vier Stunden bei längeren Operationen. Atmung zu überwachen und Verdampfer, bei Bedarf anpassen.

4. die Implantation der Stimulation und Aufnahme Elektroden

Hinweis: Autoklav alle notwendigen chirurgischen Instrumente und befolgen Sie die allgemeinen Regeln der Asepsis und Antisepsis während des gesamten Verfahrens. Berühren Sie unsterilen Bereiche außerhalb der OP-Bereich. Tauchen Sie die Elektroden in Äthyl-Alkohol (70 %) für 30 min vor der Implantation.

1. Entfernen Sie die meisten die Haare aus der Kopfhaut mit einer Haarschneidemaschine. Enthaarungscreme auf die Kopfhaut auftragen, gleichmäßig auf der Oberfläche und ein paar Minuten warten. Einem Spatel um vorsichtig die Sahne und die restlichen Haare zu entfernen. Spülen Sie die Haut mit Wasser, dann mit Desinfektionsmittel.
2. 1-2 % Lidocain zu injizieren (nicht mehr als eine Gesamtdosis von 7 mg/kg) subkutan zur Betäubung der Haut. Einen einzigen Tropfen Vet Salbe für die Augen (z.B. Paraffin) gelten.
3. Machen Sie eine gründliche und eine lange (~ 2 cm) sagittale Inzision in der Mittellinie mit einem Skalpell von der Stirn bis zum Nacken. Sezieren der Gewebe einschließlich der Knochenhaut vom Schädel, dann reinigen Sie den Bereich zwischen der Cristae der beiden Temporal Knochen mit einem Meißel oder Zahn einer Pinzette. Halten Sie den Schädel durch zurückziehen der sezierten Haut mit vier Bulldoggen ausgesetzt.
4. Sanft legen Sie feine Pinzette zwischen den steilen Rand des Schläfenbeins und Muskeln und trennen Sie sie. Machen Sie jigging Bewegungen, so viel von der großen Oberfläche des Schläfenbeins wie möglich, vorzugsweise von der Kante des Occipital Knochens auf die Ebene der koronalen Nähte, verfügbar zu machen, ohne die Muskeln.
5. Platzieren Sie Retraktoren Bitemporally um die Temporal Knochen ausgesetzt.
6. Spülen Sie die Oberfläche des Schädels mit 1-2 mL 3 % H₂O_2, dann waschen Sie es mit 1-2 mL Wasser.
7. Die Oberfläche der Temporal Knochen sehr sorgfältig an der Luft trocknen, die Feuchtigkeit mit ocular-Sticks aufwischen. Testen Sie, ob die Stimulation Elektroden auf die Oberfläche gereinigt vertikale Schädel passen (die Oberkante der Stimulationselektrode sollte im Einklang mit der Kante der Crista des Schläfenbeins). Nachjustieren Sie die Bulldogs und die Retraktoren oder prägen Sie die Stimulation Elektroden mit einer Schere, bei Bedarf.
8. Füllen Sie die Hohlräume der Stimulation Elektroden mit elektrisch leitfähige gel und legte eine dünne Schicht des Klebers auf die Felge der Elektroden.
9. Legen Sie die Stimulationselektrode auf die trockene Oberfläche des Schläfenbeins mit einer präzise Bewegung und halten Sie es fest im Ort für eine Minute mit einer feinen Pinzette. Stellen Sie sicher, dass keine Feuchtigkeit in Kontakt mit dem Kleber. MOP mit ocular-Sticks, falls erforderlich.
   Achtung: für den Fall, dass eine Instabilität der Elektrode erlebt wird, entfernen Sie es. Wiederholen Sie nach Reinigung der Knochen diesen Schritt mit einer neuen Stimulationselektrode.
10. Setzen Sie dental Zement über die Ränder der Stimulationselektrode, während die undichte Feuchtigkeit des Gewebes kontinuierlich mit ocular-Sticks getrocknet wird. Decken Sie die gesamte Stimulationselektrode mit Zement.
11. Nachdem der Kleber vollständig ausgehärtet ist, wiederholen Sie diese Schritte auf der kontralateralen Seite.
12. Bohren Sie einige Löcher überall auf den Schädel zum Ankern Schrauben. Miniatur-Schrauben in die Löcher zu fahren und legte dental Zement übergießen. Verwenden Sie ein kleinerer Durchmesser von ca. 10 % im Vergleich zu den Schraubendurchmesser Bohrkopf.
13. Je nach Zweck der Experimente einen Stecker an den Enden der Kabel Löten, legen Sie es auf die Oberfläche, und mit Zement, oder weiter Implantation Aufnahme Elektroden und Lichtleitfasern oder Vorbereiten einer kranialen Fenster über den Schädel. Löten Sie in diesem Fall die Stecker zu und Verankern sie das Konstrukt erst am Ende. Im Falle der Notwendigkeit der gleichzeitigen TES und LFP Langzeitaufzeichnungen Implantat die vorgenannten Elektrode Drillinge anstelle von einzelnen Drähten.
    Hinweis: Dieses Setup ermöglicht die Entfernung von gemeinsamen Modus Stimulation Artefakte⁸. Für die Details der Aufnahme Elektrode Implantation siehe vorherigen Protokolle^14,15.
14. Waschen Sie die exponierten Geweben reichlich mit Desinfektionsmittel. 1-2 % Lidocain zu injizieren (nicht mehr als eine Gesamtdosis von 7 mg/kg) subkutan.
15. Debride Wundränder und schließen Sie sie mit einfachen unterbrochene Nähte um den Connector/Implantat. Desinfizieren Sie die Wunde mit Povidon-Jod.
16. Carprofene 5 mg/kg subkutan zu injizieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang, wenn nötig.
    Hinweis: Andere Analgetika können entsprechen die Anforderungen der lokalen ethischen Berechtigung Board verwendet werden.
17. Auszusetzen, Anästhesie, release Earbars und Nasensteg und setzen Sie das Tier in einem Käfig postoperative Erholung, um wieder zu Bewusstsein kommen.
18. Stellen Sie sicher, dass das Tier unter strenger Aufsicht in den ersten postoperativen Stunden. Weiterhin die Implantat-Bereich in regelmäßigen Abständen zu überwachen.
    Hinweis: Das Tier sollte nicht unbeaufsichtigt gelassen werden bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat. Haus das Tier individuell bis zur endgültigen Genesung von der Prozedur.

Die Implantation von Elektroden chronische Stimulation (Abbildung 1 b) kombinierbar mit zusätzlicher Implantation von Elektroden (Abbildung 1-D) aufnehmen. Diese Einstellungen eignen sich zur Anforderungs-Aufnahme und Stimulation Systeme mit spezifischen Hirnaktivitäten stören bilden. Hier präsentieren wir repräsentative Ergebnisse einer geschlossenen Epilepsie-Erkennung und Interventionssystem, angewendet auf Long-Evans-Ratten, die mit dem Ausdruck spontaner Anfälle (Abbildung 2A)⁹. Diese Sorte ist bekannt, die elektrographischen und Verhaltensstörungen Symptome fehlen (Petit Mal) Epilepsie (Abb. 2 b). Im Falle eines epileptischen Anfalls, als die aufgezeichneten intracortical Signale werden in Echtzeit analysiert, ein Trigger wird gesendet, um einen isolierten Reiz-Generator zum geeigneten Zeitpunkt die Spike-Wave-Aktivität des Gehirns beeinträchtigen. Im Gegenzug liefert der Impuls-Generator kostenlos-ausgewogen, triphasische Anregung durch die Bitemporal Stimulation Elektroden um die Anfallsaktivität zu unterbrechen.

Abbildung 2-D zeigt die Kapazität der zeitlich gezielte Reize unterbrechen laufende Anfälle von Woche 1 Woche 16, demonstriert die Robustheit und Zuverlässigkeit der Elektroden implantiert Stimulation. Um diese Ergebnisse in Zusammenhang zu bringen, zeigt Abbildung 2E die Aufzeichnungen eines abgebrochenen Experiments, wo sekundäre Gewebe eingedrungen zwischen dem Felsenbein und Elektrodenoberfläche durch die unsachgemäße Abdichtung und Zementierung der Elektroden (Autopsie von der Tier bestätigt die Gewebe-Invasion). Neben der Erhöhung der Impedanz der Stimulation Elektroden, dürfte die wachsende Gewebe ein elektrischer Shunt zur Verfügung zu stellen. Dieses Experiment unterstreicht die äußerste Bedeutung der sorgfältige Isolierung, zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse während der Stimulation Experimente zu erreichen.

Abbildung 1: Schritte der Stimulation und Aufnahme Elektrode Fabrikation. (A) verdrehte Kabel durch die Löcher genäht und fixiert die Verpackung vor dem wickeln die geschälte Drähte in die Hohlräume. (B) endgültige Form der Stimulation Elektroden. Einschub: gewickelt Drähte im Inneren der Verpackung; (C) Seitenansicht der Aufnahme Elektroden; (D) Draufsicht der Aufnahme Elektroden. Einschub: Tipp der Aufnahme Seiten, 400 µm-Abstand. (E) Intraoperative Bild der Transkranielle Stimulation Elektrode Platzierung. Die Stimulation-Elektroden sind bereits implantiert, zusammen mit einigen der Verankerung Schrauben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse der geschlossenen Beschlagnahme Intervention durch die Stimulation Elektroden dieses Protokolls. (A) Closed-Loop-Systemübersicht. Triplett Aufnahme Elektroden werden in der parietalen Kortex und Stimulation Elektroden sind Bitemporally auf dem Schädel. Die Ratte ist ausgestattet mit einem Verstärker am Kopf und an einem Echtzeit-Beschlagnahme-Detection-System angeschlossen. (B) LFP Spur eine ununterbrochene Spike-Wave-Beschlagnahme (C und D) Beispiel LFP Spuren der Beschlagnahme Intervention auf der 1^St und^th 16-wöchigen der Stimulation. (E) Beispiel für Versagen der Beschlagnahme Unterbrechung bei Gewebe wächst zwischen den Elektroden Stimulation und das Felsenbein (bestätigt durch Autopsie) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Der wichtigste Schritt dieses Protokolls ist das Verkleben von der Elektrode-Paket auf der Knochenoberfläche. Bei unsachgemäßer Abdichtung, entsteht eine Lücke zwischen den Elektroden und den Knochen, und sekundäre Narbengewebe kann wachsen in diese Lücke, die die Qualität der Stimulation verringert. Die Knochenoberfläche muss komplett trocken sein, während der Schritte auf das Paket kleben und bei Instabilität der Elektroden zu erleben, muss es entfernt und ersetzt mit einem neuen Paket um die besten Ergebnisse zu erhalten.

Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass wie die Haut nach der Operation nicht vollständig geschlossen ist, gibt es ein relativ höheres Risiko einer Infektion. Postoperative Pflege in den ersten 4-5 Tagen während der Wiederherstellung mit Desinfektionslösung und später mit Pulver, hilft, um Infektion zu verhindern. Nach unserer Erfahrung erleichtert diese Behandlung die Bildung von Narbengewebe, die vollständig die Wunde gegenüber der Außenwelt schließen können.

Hier haben wir eines der billigsten, am leichtesten zugänglichen Methoden der Elektrode Fertigung, aber je nach den besonderen Bedürfnissen der besonderen Experimente, Änderung des leitenden Materials notwendig sein kann, z.B.Beschichtung der Oberfläche der Kabel mit nicht polarisierenden Schnittstelle Elektrodenmaterialien, z.B.Ausbildungsstellen. Die Elektrode-Paket kann nach Maß, 3D gedruckt und geändert durch die Experimentatoren, bei unseren Empfehlungen entsprechen nicht die Anforderungen einer bestimmten Studie. Nach unserer Erfahrung die Größe der transkraniellen Elektroden hergestellt in dieser Studie erlauben Implantationen bei männlichen und weiblichen Ratten über 300 g Körpergewicht, aber die Größe der Elektroden Stimulation kann leicht durch kleinere Streifen schneiden, im Protokoll Schritt reduziert werden 1.3. Darüber hinaus können die Leime und zahnmedizinische Zemente gemäß dem Protokoll ersetzt werden, mit Ersatz, wenn man bedenkt, dass die äußere Schicht ist in direktem Kontakt mit dem Gewebe, daher, dass sie Bio-kompatibel sein sollten.

In der vorliegenden Studie stellten wir ein Protokoll für Bitemporal Stimulation Elektrode Herstellung und Implantation, was technisch einfach durchzuführen, kostengünstig und zuverlässig auf lange Sicht, so dass elektrische Stimulation Experimente auf frei Verschieben von Ratten⁹. Da die Stimulation Elektroden auf dem Felsenbein befinden, wird die gesamte horizontale Schädel Oberfläche für andere Implantationen beibehalten. Diese Methode ist kombinierbar mit regelmäßigen elektrophysiologische^15,16, optogenetische¹⁷, und¹⁸ Abbildungsverfahren, bietet die Möglichkeit, eine vielseitige Kombination von experimentellen Protokollen.