Stimolazione elettrica transcranica cronica e registrazione intracorticale in ratti

Stimolazione elettrica transcranica (TES) è un approccio metodologico prezioso per influenzare l'attività cerebrale in modo temporalmente limitato. A seconda delle dimensioni e il posizionamento degli elettrodi di stimolazione, TES può interessare volumi cervello grande e salire sul treno popolazioni neuronali diffuso^1,2,3. La stimolazione transcranica diretta corrente è già medicamente approvata per il trattamento del disturbo depressivo maggiore^4,5e molti si concentrano studi per mostrare gli effetti cognitivi della stimolazione transcranica in esseri umani^{6 , 7}. Inoltre, promettenti risultati sono stati segnalati per quanto riguarda il potenziale di TES nel controllare i grippaggi epilettici^8,9.

Nonostante l'intensa attività di ricerca, ci sono ancora molte questioni aperte per quanto riguarda il meccanismo dettagliato della azione, effetti collaterali e il risultato a lungo termine dell'applicazione di questo metodo^10,11,12. Di conseguenza, è estremamente importante avere un protocollo affidabile, riproducibile per studiare gli effetti di TES in modelli animali. Dato che molti disturbi (ad es., depressione, epilessia e schizofrenia) possono solo essere estesamente studiati in animali svegli, e la natura di queste condizioni mediche solitamente richiedono il trattamento a lungo termine, forniamo un protocollo per la cronica impianto di elettrodi di transcranial in ratti. Il metodo qui presentato può essere utilizzato per studi comportamentali o può essere combinato con l'impianto di elettrodi di registrazione (cioè, fili, sonde in silicone, juxtacellular elettrodi) o con windows cronica cranica per esperimenti elettrofisiologici e formazione immagine studia, rispettivamente. Secondo il disegno sperimentale, la tempistica degli stimoli può essere casuale o attivati da un evento per spunti comportamentali specifiche, o per le caratteristiche elettrofisiologiche del cervello particolare Stati (sequestri, oscillazioni di teta)^{8, 11 , 13}.

È importante ricordare che in contrasto con l'approccio umano attualmente utilizzato, che utilizza un incorporamento di elettrodi posizionati sulla pelle, qui vi mostriamo un metodo che utilizza la destra l'impianto sottocutaneo sopra la superficie dell'osso temporale, dal ratti a malapena tollerare qualsiasi elemento posizionato sulla loro pelle che è facilmente raggiungibile utilizzando le zampe.

In linea con i principi della sostituzione, riduzione e raffinatezza, a causa della natura cronica dell'impianto, questo metodo aiuta a ridurre il numero di animali, dal momento che ogni animale possa essere reclutati in differenti condizioni sperimentali per mesi, consentendo l'uso di meno animali per testare varie ipotesi.

Nello studio presente, forniamo un protocollo dettagliate dell'elettrodo di stimolazione transcranica (Figura 1A-B) di produzione e dimostrare l'impianto cronico di questi elettrodi su ossa temporali di un six-month-old ratto maschio lungo Evans.

Tutti i metodi descritti qui sono in conformità con le direttive del Consiglio delle Comunità europee (86/609 ECC) e sono stati approvati dal comitato etico per la ricerca animale presso l'Albert Szent-Györgyi medica e farmaceutica Center dell'Università di Szeged (XIV/218/2016).

1. fabbricazione di elettrodi di stimolazione

1. Per rendere una stimolazione dell'elettrodo, tagliata sei pezzi 10 cm di lunghezza dei fili di aggancio in miniatura, rimuovere 2 cm di rivestimento su un'estremità e 1 cm su altra estremità.
2. Attorcigliare due cavi e saldarli al lato più corto di pelati.
3. Acquisire una striscia di tre confezioni di nastro di qualsiasi circuito integrato con cassa SOT-353.
4. Cucire i fili intrecciati attraverso i tre fori del pacchetto. Il segmento più pelato dei fili dovrebbe essere nelle cavità del pacchetto. Posizionare i cavi in modo che la fine dell'isolamento è in linea con il bordo dei fori.
5. Mettere il cemento dentale sui fori per fissare i fili.
   Attenzione: Il cemento dentale deve essere abbastanza denso per evitare perdite nella cavità del pacchetto.
6. Una volta che il cemento è solidificato (minimo 10 min), il pacchetto flip e mettere un sottile strato di colla nel foro per formare un sigillo a tenuta stagna verso il cemento poroso. Evitare di incollare i fili pelati.
7. Attorcigliare i cavi sul lato più corto di pelati e saldarli (Figura 1A).
8. Afferrare il segmento più pelato dei fili con la punta delle pinzette bene, arrotolarle intorno e avvolgerli nelle cavità (Figura 1B). Tagliare il cavo in eccesso, se necessario.

2. fabbricazione di elettrodi di registrazione

1. Per effettuare una registrazione dell'elettrodo tripletto (Figura 1-D), taglia un pezzo lungo un cm di tubo in acciaio inox utilizzando rotante ad alta velocità ha visto. Togliere la pinna dalle estremità del tubo con un ago appuntito e assicurarsi che il tubo sia pulito di detriti e completamente permeabile.
   Nota: Non utilizzare pinze, come essi falserà il tubo.
2. Piegare un lamierino distanziatore placcato oro bordo con una lunghezza minima di 3 cm per formare un supporto J-figura. Tagliare la gamba più lunga della forma 'J' e saldare insieme per ottenere indietro la forma originale di realizzare una giunzione staccabile tra la parte lineare lunga, che si terrà dal dispositivo stereotassica, e la forma di 'U', in modo da tenere l'elettrodo e servire come un punto di ancoraggio . Incollare il tubo e la gamba più corta del titolare 'J' insieme. Colla, alcune barre di lunghezza aggiuntiva di 1 cm, se necessario, per la stabilità.
3. Tagliare 3 pezzi di fili elettrodo lungo 2,5 cm in acciaio inox, forbici ultrafini. Assicurarsi che si tratta di un taglio di chiaro e nitida, e l'isolamento è intatta la superficie circolare del filo elettrodo. Assicurarsi inoltre che la punta di taglio non è piegata a causa della forza applicata. Piegare 1 o 2 mm a un'estremità di ciascuno dei fili ad angoli diversi (ad es., una sinistra dritto, uno 45 ° e un angolo retto) per renderli distinguibili.
4. Riempire il tubo con i fili, scegliere un'appropriata spaziatura degli elettrodi per l'esperimento (ad es., per campo potenziale locale corticale (LFP) e registrazione di densità (CSD) fonte corrente, la sporgenza raccomandata delle punte dei fili dalla apertura del tubo: 4,5 mm e 4,1 mm 3,7 mm, rispettivamente). Nota quale filo corrisponde a quale profondità per mantenere un ordine corretto.
5. Una volta che i fili Allinea a destra vicino a vicenda e sono paralleli con il tubo, per fissare i cavi degli elettrodi, posizionare una sola goccia di colla liquida a entrambe le estremità del tubo con un ago appuntito. Assicurarsi che la colla è che scorre nel tubo a causa dell'effetto capillare, ma non verso i siti di registrazione alle estremità sporgenti.
6. Preparare una scheda di interfaccia di elettrodo con un microconnettore corretto compatibile con il sistema di registrazione per essere utilizzato.
7. Introdurre l'estremità non-registrazione, piegata dei fili nei fori della scheda di interfaccia elettrodo corrispondente al canale di registrazione desiderato. Quando tutti i fili sono in posizione, spingere i pin dorati nei fori con le pinzette.
   Nota: Perni di oro possono essere fissati in posizione utilizzando cemento dentale, ma nella maggior parte dei casi, è abbastanza stabile anche senza questo passaggio di sicurezza.

3. anestesia

1. Metti l'animale in una camera di induzione di anestesia sigillato e riempirlo con 4-5% di isoflurane in aria medicale 2 L/min.
2. Quando il ratto è recumbent, rimuovere l'animale dalla camera e posizionarlo in una cornice stereotassica con un pezzo di naso di adeguata ventilazione.
3. Impostare il livello di isoflurane al 2%, anche se il tasso del flusso d'aria deve rimanere la stessa. Controllare il livello dell'anestesia. Se c'è un'assenza del riflesso di ritiro della zampa in risposta a pizzicare, continuare, altrimenti aumentare la profondità dell'anestesia.
4. Monitorare e mantenere la temperatura corporea del ratto a 37 ± 0,5 ° C con un sistema di monitoraggio omeotermi. Applicare una goccia di unguento di paraffina sugli occhi per prevenire la disidratazione della cornea. Ripetere questa procedura durante l'intervento chirurgico più volte, se necessario.
5. Iniettare per via sottocutanea di 0,3 mg/kg atropina per evitare la formazione di muco nelle vie aeree. Ripetere questa operazione ogni quattro ore in caso di interventi chirurgici più lunghi. Monitorare la respirazione e regolare del vaporizzatore, se necessario.

4. l'impianto della stimolazione ed elettrodi di registrazione

Nota: Autoclave tutto il necessario chirurgico degli strumenti e seguire attentamente le norme generali di asepsi e antisepsi durante l'intera procedura. Evitare di toccare le aree non sterile all'esterno dell'area chirurgica. Immergere gli elettrodi in alcol etilico (70%) per 30 min prima dell'impianto.

1. Rimuovere la maggior parte dei capelli dal cuoio capelluto con un tagliatore di capelli. Applicare la crema depilatoria sul cuoio capelluto, distribuirlo uniformemente sulla superficie e attendere qualche minuto. Usare una spatola per rimuovere delicatamente la panna e i capelli rimanenti. Sciacquare la pelle con acqua, poi con un disinfettante.
2. Iniettare lidocaina 1-2% (non superare una dose totale di 7 mg/kg) per via sottocutanea per intorpidire la pelle. Applicare una sola goccia di Unguento veterinario per gli occhi (per esempio, paraffina).
3. Fare un'approfondita e un'incisione sagittale lunga (~ 2 cm) sulla linea mediana con un bisturi, dalla fronte al collo. Sezionare i tessuti compreso il periostio dal cranio, quindi utilizzando una pinzetta scalpello o dente pulire l'area tra cristae delle due ossa temporali. Mantenere il cranio esposto ritraendo la pelle dissecata utilizzando quattro bulldogs.
4. Delicatamente posto bene pinzette tra il bordo ripido dell'osso temporale e i muscoli e separarli. Fare movimenti jigging per esporre come gran parte della grande superficie dell'osso temporale possibile, preferibilmente dal bordo dell'osso occipital al piano delle suture coronali, senza danneggiare i muscoli.
5. Posto bitemporally Divaricatori per mantenere le ossa temporali esposte.
6. Sciacquare la superficie del cranio con 1-2 mL 3% H₂O_2, poi lavare con 1-2 mL di acqua.
7. Asciugare la superficie delle ossa temporali molto attentamente, assorbire l'umidità con bastoni oculare. Verificare se gli elettrodi di stimolazione adatta sulla superficie pulita cranio verticale (bordo superiore dell'elettrodo stimolazione dovrebbe essere in linea con il bordo del crista dell'osso temporale). Ri-regolare i bulldogs e i divaricatori o gli elettrodi di stimolazione di forma con le forbici, se necessario.
8. Riempire le cavità della stimolazione elettrodi con electroconductive gel e mettere un sottile strato di colla sul cerchio degli elettrodi.
9. Posizionare l'elettrodo di stimolazione sulla superficie asciutta dell'osso temporale con un movimento preciso e tenerlo saldamente in posizione per un minuto con le pinzette bene. Assicurarsi che l'umidità non sia a contatto con la colla. Assorbire con bastoni oculare, se necessario.
   Attenzione: nel caso in cui qualsiasi instabilità dell'elettrodo è vissuto, rimuoverlo. Dopo la pulizia l'osso, ripetere questo passaggio con un nuovo elettrodo di stimolazione.
10. Mettere cemento dentale oltre i bordi dell'elettrodo di stimolazione, mentre l'umidità che perde dei tessuti è continuamente prosciugato con bastoni oculare. Coprire l'elettrodo di stimolazione intero con cemento.
11. Dopo che il cemento è completamente indurito, ripetere questi passaggi sul lato controlaterale.
12. Praticare dei fori in tutto il cranio per viti di ancoraggio. Guidare in miniatura viti nei fori e mettere cemento dentale su di loro. Uso un diametro più piccolo di ~ 10% rispetto al diametro della vite di testa del trapano.
13. A seconda dello scopo degli esperimenti, un connettore per le estremità dei cavi di saldatura, posizionarlo sulla superficie e coprire con cemento, o continuare impiantare gli elettrodi di registrazione e le fibre ottiche o preparare una finestra cranica sopra il cranio. In quest'ultimo caso, saldare i connettori e ancorarli al costrutto solo alla fine. In caso di necessità di registrazioni simultanee a lungo termine di TES e LFP, impiantare le triplette di suddetto elettrodo invece di singoli fili.
    Nota: Questa configurazione permette la rimozione di comuni modalità stimolazione manufatti⁸. Per i dettagli dell'impianto di elettrodi di registrazione, vedere precedenti protocolli^14,15.
14. Lavare i tessuti esposti abbondantemente con un disinfettante. Iniettare lidocaina 1-2% (non superare una dose totale di 7 mg/kg) per via sottocutanea.
15. Sbrigliare i bordi della ferita e chiuderle con i suturare interrotti semplici intorno il connettore/impianto. Disinfettare la ferita con povidone-iodio.
16. Iniettare carprofene 5 mg/kg per via sottocutanea. Ripetere l'operazione se necessario.
    Nota: Eventuali altri analgesici possono essere utilizzati i requisiti prefissati dal Consiglio locale permesso etico di corrispondenza.
17. Sospendere l'anestesia, rilasciare il earbars e il nasello e mettere l'animale in una gabbia di recupero post-operatorio per ritrovare la coscienza.
18. Assicurarsi che l'animale è sotto stretta supervisione durante le prime ore postoperatorie. Continuare a monitorare periodicamente l'area dell'impianto.
    Nota: L'animale non deve essere lasciato incustodito fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Casa l'animale individualmente fino al completo recupero dalla procedura.

L'impianto di elettrodi di stimolazione cronica (Figura 1B) può essere combinato con un ulteriore impianto di elettrodi (Figura 1-D) di registrazione. Tali impostazioni sono adatti per formare sistemi di stimolazione per interferire con le attività specifiche del cervello e registrazione su richiesta. Qui presentiamo i risultati rappresentativi di un rilevamento di epilessia di circuito chiuso e sistema di intervento, applicato sui ratti lungo Evans esprimendo la crisi epilettiche spontanee (Figura 2A)⁹. Questo ceppo è noto per mostrare i sintomi comportamentali ed elettrografici delle assenze (piccolo male) (Figura 2B). In caso di un attacco epilettico, come il registrato segnali intracorticali sono analizzati in tempo reale, un trigger viene inviato ad un generatore di stimolo isolato al momento opportuno per interferire con l'attività di punto-e-fluttua del cervello. A sua volta, il generatore di stimolo fornisce un carica-equilibrato, trifasici stimolo attraverso gli elettrodi di stimolazione di bitemporal al fine di interrompere l'attività di sequestro.

Figura 2-D Mostra la capacità degli stimoli temporalmente mirati ad interrompere i sequestri in corso dalla settimana 1 alla settimana 16, dimostrando la robustezza e l'affidabilità degli elettrodi di stimolazione impiantato. Per mettere questi risultati nel contesto, Figura 2E consente di visualizzare le registrazioni di un esperimento abortito, dove il tessuto secondario penetrato tra l'osso temporale e la superficie dell'elettrodo a causa di improprio tenuta e cementazione degli elettrodi (l'analisi della animale ha confermato l'invasione del tessuto). Oltre ad aumentare l'impedenza degli elettrodi di stimolazione, il tessuto crescente rischia di fornire uno shunt elettrico. Questo esperimento evidenzia l'importanza assoluta di isolamento attenzione per ottenere risultati affidabili e riproducibili durante gli esperimenti di stimolazione.

Figura 1: fasi di stimolazione e la fabbricazione di elettrodi di registrazione. (A) Twisted fili cuciti attraverso i fori e fissato alla confezione prima di avvolgere i fili pelati nelle cavità. (B) forma finale degli elettrodi di stimolazione. Inserto: avvolto fili all'interno della confezione; Lato (C) Mostra gli elettrodi di registrazione; (D) gli elettrodi di registrazione vista superiore. Inserto: Suggerimento dei siti di registrazione, 400 µm spaziatura. (E) immagine Intraoperative del posizionamento degli elettrodi di stimolazione transcranica. Gli elettrodi di stimolazione sono già impiantati, insieme ad alcuni le viti di ancoraggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: risultati rappresentativi dell'intervento di sequestro di circuito chiuso usando gli elettrodi di stimolazione del presente protocollo. (A) Panoramica sistema Closed-loop. Gli elettrodi di registrazione di tripletto sono impiantati nella corteccia parietale e stimolazione elettrodi bitemporally sul cranio. Il ratto è dotato di un amplificatore su testa e collegato ad un sistema di rilevazione di grippaggio in tempo reale. (B) LFP traccia di un tracce di esempio LFP ininterrotto sequestro di punto-e-fluttua (C e D) di intervento di sequestro il 1^st e 16^ª settimana di stimolazione. (E) esempio di errore di interruzione di sequestro in caso di tessuto crescente tra gli elettrodi di stimolazione e dell'osso temporale (confermato dall'autopsia) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La fase più critica del presente protocollo è l'incollaggio del pacchetto degli elettrodi sulla superficie dell'osso. In caso di impropria tenuta, un gap si forma tra gli elettrodi e l'osso e tessuto cicatriziale secondaria può crescere in questa lacuna, che diminuisce la qualità della stimolazione. La superficie dell'osso deve essere completamente asciutta durante la procedura di incollaggio sulla confezione, e nel caso di verifica di instabilità degli elettrodi, deve essere rimosso e sostituito con un nuovo pacchetto per ottenere i migliori risultati.

Una limitazione di questo metodo è che, come la pelle non è completamente chiuso dopo la chirurgia, c'è un relativamente elevato rischio dell'infezione. Cure post-operatorie nei primi 4-5 giorni durante il recupero con soluzione disinfettante e successivamente con polvere, aiuta a prevenire l'infezione. Nella nostra esperienza, questo trattamento facilita la formazione di tessuto cicatriziale, che può chiudere completamente la ferita verso il mondo esterno.

Qui abbiamo presentato uno dei metodi più economici, più accessibili di fabbricazione di elettrodi, ma a seconda delle speciali esigenze degli esperimenti particolare, modifica del materiale conduttivo può essere necessario, ad esempio, rivestire la superficie dei cavi con non-polarizzazione materiali dell'elettrodo interfaccia, ad esempio, PEDOT:PSS. Il pacchetto di elettrodo può essere su misura, stampa 3D e modificati dagli sperimentatori, nel caso nostro consigli non corrispondono ai requisiti di un particolare studio. Nella nostra esperienza, la dimensione degli elettrodi transcranial fabbricato in questo studio permetterà di attecchimenti in ratti maschi e femminili sopra 300 g di peso corporeo, ma la dimensione degli elettrodi di stimolazione può essere facilmente ridotto tagliando strisce più piccole nel passaggio di protocollo 1.3. Inoltre, tutti i collanti e cementi odontoiatrici dati nel protocollo possono essere sostituiti con i sostituti, considerando che lo strato esterno è in contatto diretto con i tessuti, pertanto che dovrebbero essere bio-compatibili.

Nello studio presente, abbiamo fornito un protocollo per la fabbricazione di elettrodi di bitemporal stimolazione e l'impianto, che è tecnicamente semplice da eseguire, conveniente e affidabile a lungo termine, consentendo esperimenti di stimolazione elettrica su liberamente ratti⁹in movimento. Come gli elettrodi di stimolazione sono posizionati dell'osso temporale, la superficie del cranio intero orizzontale è conservata per altri impianti. Questo metodo può essere combinato con regolari elettrofisiologici^15,16, optogenetica¹⁷e¹⁸ tecniche, fornendo la possibilità di una combinazione versatile di protocolli sperimentali di formazione immagine.