En automatisert rask iterativ Negative Geotaxis analysen for å analysere voksen klatring atferd i Drosophila modell av Neurodegeneration

En rekke protokoller og metoder har blitt utviklet for å analysere Drosophila voksen klatring atferd. Ganske arbeidskrevende, tradisjonelle analyser det meste innebærer å plassere en enkelt fly i en enkelt medisinglass og bruker en manuell kraft trykke flyr ned for synkronisering^1,2,3,4. Det er kjedelig og tidkrevende, uegnet for store høy gjennomstrømming studier, og har potensielle varianter av manuell kraften brukes til å trykke ned fluene samt andre begrensninger. For å forbedre analysen, utviklet en rask iterativ Negative Geotaxis (RING) analyse som lar høy gjennomstrømming analyse over mange fluer på samme tid⁵. Analysen krever imidlertid fortsatt en manuelt øve kraft til å synkronisere fly handling. Vår versjon av RING analysen, revidert på forrige analysen, inkluderer en metallisk basis hosting flere fly inneholder ampuller automatisk blir kontrollert av en elektrisk motor for å kjøre fly synkronisering⁶. Ved opptak, fly klatring umiddelbart etter synkronisering registreres deretter analysert benytter en egenutviklede programvare. Våre automatiserte RING analysen har eliminert den kjedelige og arbeidskrevende prosessen i innsamling av data fra en enkelt fly, en om gangen, og aktivert data oppkjøpet bli mer effektiv. I tillegg har automatisert RING analysen vært ansatt i en rekke studier for å belyse mekanisme underliggende Alzheimers og Parkinsons sykdom, validere tilnærming med høy effektivitet^7,8,9 .

I denne artikkelen viser vi automatisert RING analysen med DDC-Gal4 drevet RNAi fluer. DDC-Gal4 er en Gal4 linje spesielt uttrykke i dopaminergic (DA) og serotonergic neurons, og dermed representerer et flott verktøy for å analysere målet genet effektene knyttet locomotor underskudd følger neurodegeneration¹⁰. I tillegg innlemme vi UAS-Dicer2, en fly linje som forbedrer RNAi effektivitet, for å generere UAS-Dicer2; DDC-Gal4 verktøyet linje. RNAi fluene vi velger å bruke er auxilin (aux) RNAi v16182 (auxR¹⁶¹⁸²), et gen som vi tidligere har funnet for å ha en effekt på fly locomotor aktivitet⁸. auxGFP flyr er også utarbeidet for å analysere virkningene på aux overuttrykte. Vi vil vise hvordan du bruker automatiserte RING analysen å måle fly negative geotaxis presentere resultatene og diskutere noen implikasjoner fra resultatene.

1. fly samling

1. opprettholde fluene standard fly mat på 25 ° C, 70% fuktighet og en 12 h/12 h lys/mørke syklus.
2. Samle UAS-Dicer2; DDC-GAL4 fly virginsunder karbondioksid (CO ₂) anestesi.
3. Over disse jomfruer til 2 dagers gammel voksne mannlige fluer bærer de følgende genotyper: UAS-mCD8GFP (kontroll), auxR ¹⁶¹⁸² (aux RNAi) auxGFP (aux overuttrykte), og auxR ¹⁶¹⁸²; auxGFP (hjelpe), med en mann: kvinne forholdet 1:2.
4. Separat samle nylig eclosed menn og kvinner i 3 ampuller for hver gruppe per forsøk, å plassere 10 fluer i hvert vanlige fly hetteglass med standard mat på 25 ° C.
5. Avhengig av eksperimentet, holde de innsamlede flyr opp til 35 dager og bruke dem for automatisk RING analyse på dag 5, 15, 25 og 35.

2. Automatisert RING analysen

1. overføre 10 samlet fluer (unisex) per genotype i hver medisinglass, så sikre ampullen med en skrue. Analysere kontroll fluer og fluer bærer ulike genotyper sammen for hvert sett av eksperimenter (opptil 10 ampuller samtidig 10 fluer i hvert hetteglass).
2. Slå på digitalkameraet plassert foran apparatet, og starte innspillingen en gang flyr er lastet og klar.
3. Etter at 1 min for fluer å bosette seg i hetteglass, slå på trinn kontrolleren som styrer trinn driveren; dette driver små elektriske motoren å kontrollere spaken festet slik at det fortløpende stiger og kraner apparatet 4 ganger i 2 s. Se figur 1.
   1. Etter tappe, merke at fluene begynne å stige veggen. Sikre at innspillingen fortsetter.
4. Gjenta synkronisering som beskrevet i trinn 2.3 i 60-s intervall for 3 til 5 påfølgende forsøk.
5. Gjenta eksperimentet for 5, 15, 25 og 35 dagers gammel fluer. Gjennomføre minst 3 uavhengige eksperimenter for hver gruppe, hvert eksperiment med minst 30 samlet flyr (3 flasker).

3. Dataanalyse

1. importere innspilt video til datamaskinen.
2. Ta et øyeblikksbilde av videoen på 6 s etter trykke, for hvert forsøk.
3. Importere øyeblikksbildet til RflyDetection programvaren (se figur 2), bruker den ' filen ' menyen.
4. Angi øvre og nedre grunnlinjene av ampullen nettopp ved hjelp baseline ikonet på verktøylinjen og deretter bruke markøren for å merke øvre og nedre grunnlinjene på bildet.
5. Inn nummeret fluer per medisinglass (f.eks, 10 her) den ' Flys i rect ' feltet og medisinglass lengde (f.eks 14 cm her) i den ' Tube høyde ' felt i Innstillinger-kategorien.
   1. Merk at enkelte fly stillingene er oppdaget og merket med prikker på skjermen for hvert hetteglass.
      Merk: Figur 2 viser plasseringen av alle menyen knappeklikk.
6. Oppmerksom på at programvaren automatisk bestemmer klatring avstanden for hvert fly og viser de gjennomsnittlige verdiene fra 10 fluer i hvert hetteglass i en tabell på høyre panel. (Se figur 2)
7. Behandle klatring nummeret med statistisk programvare (f.eks prisme) for ytterligere statistikkanalyse.
8. Presentere dataene som mener ± SEM.
9. Beregne p-verdier av betydning (angitt med stjerner * p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < 0,001) med enveis ANOVA Bonferroni flere sammenligning test

Denne artikkelen viser bruk av automatiserte RING analysen vurdere fly negative geotaxis atferd. I motsetning til forrige RING analysen, analysen vår inkluderer et automatisert apparat som gir en elektrisk kraft til å synkronisere fly handling og analyserer opp til hundrevis av fluer samtidig (figur 1). Analyse av Dicer2; DDC > auxR¹⁶¹⁸² fluer viste en alder-avhengige nedgang i klatring avstanden i en 6-s tidsramme for både mannlige og kvinnelige fluer, antyder at aux uttrykk i DA neurons er avgjørende for fly locomotor aktivitet. Klatring evne synes ikke å påvirkes ved auxGFP overuttrykte i DA neurons, og co uttrykk for auxR¹⁶¹⁸² og auxGFP i DA nevroner reddet RNAi fenotypen (figur 2 og Figur 3). I tillegg til å validere automatisert RING analysen som en høy gjennomstrømming og effektiv tilnærming for å vurdere motor feil forbundet med DA Nevron degenerasjon, indikerer disse resultatene også at denne automatiserte tilnærming er nyttig i å identifisere potensielle Parkinsons sykdomsrisiko og gir en anelse om deres nevrodegenerative funksjon.

Figur 1. Automatisert RING apparatet. (A og B) foran og bak visninger av apparater: kontakt 1, loddrett stål stang (2), en skrue for å sikre tube på rammen (3), gjennomsiktig plast ampuller (4), skum bar (5), metall base (6), mikro-trinn driveren (7), elektronisk kontrolleren (8), bryteren (9), liten elektrisk motor (10) og spaken knyttet til små elektriske motoren (11). Rektangulær metallramme er 46 cm x 26 cm × 16 cm, holder 10 gjennomsiktig plast ampuller (2.1 cm i diameter, høyde 14,5 cm) sikret med skruer. For å slå på apparatet, først klikker på bryteren (9), som aktiverer (8), (7), og (10) følgelig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Analyse av en representant bilde bilde av RflyDetection. Øyeblikksbildet er importert til programmet RflyDetection og handling for hvert ikon på grensesnittet angis med teksten til høyre. Når topp- og grunnlinjene, programvaren automatisk oppdager og markerer fly posisjonen i ampullen. Klatring avstanden (cm) i 6 s for hvert fly og gjennomsnitt verdiene for hvert hetteglass vises i en tabell. Disse tallene importeres deretter til statistisk programvare for ytterligere statistisk analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Statistisk søylediagrammer viser en alder-avhengige nedgang i fly klatring evne når aux uttrykket er downregulated i DA neurons. Automatisert RING analysen ble brukt til å analysere negative geotaxis virkemåte for fluer bærer de følgende genotyper: auxR¹⁶¹⁸²/ + (ingen Gal4), UAS-Dicer2; DDC-Gal4 fluer krysset til w¹¹¹⁸ (kontroll), UAS-mCD8GFP (kontroll), auxR¹⁶¹⁸², auxGFPog auxR¹⁶¹⁸², auxGFP (redning). Merk at både mannlige og kvinnelige fluer klatret betydelig tregere over tid når aux uttrykket ble redusert i DA neurons. Locomotor underskuddene ble reddet ved gjeninnføre aux uttrykk. Fluer 5, 15, 25 og 35 dagers gammel ble vurdert. Mann (A) og kvinnelige (B) flyr vises separat. Legender med genotype etiketter tilsvarer ulike stang fargene vises til høyre. Data vises så bety ± SEM. p-verdier av betydning (angitt med stjerner * p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, ns: ingen betydning, en bar ble trukket under stjernene til å angi objektene sammenligne) ble beregnet sammenligne mCD8GFP kontrollen eller aux RNAi med enveis ANOVA Bonferroni flere sammenligning test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Automatisert RING analysen beskrevet her kan en høy gjennomstrømming analyse av fly negative geotaxis for hundrevis av fluer samtidig. Tidligere eksisterende strategier for å analysere voksen klatring involverer observasjoner av en enkelt fly i en enkelt medisinglass og fly posisjon registreres manuelt av øyet. Denne ganske kjedelige prosessen kan noen ganger forårsake feiltolking eller feiltolkning av data, samt arbeidskrevende arbeid. Analysen vår automatiserte RING starter med et enkelt klikk, og apparatet automatisk synkroniserer og vurderer klatring evnen til opptil 100 fluer. Elektrisk synkroniseringen gir en mer nøyaktig måte å kontroll tid og andre parametere, så generelle fange av fly voksen klatring prosessen kan måles nøye.

Deretter med vår egenutviklede RflyDetection programvare, kan nøyaktige fly plassering identifiseres. Programvaren tar i betraktning den generelle 2D medisinglass området (bestemmes av rammen), og topp og bunn grunnlinjene, før anskaffe stillinger for alle fluer i det angitte området, og presenterer dem som prikker. I tillegg lar den automatiske beregningen av klatring avstand og gjennomsnitt verdiene raskere og enklere datamanipulasjon. Datasett over en stor gruppe av fluer kan plausibly samles og analyseres innenfor en rimelig tidsramme^7,8,9.

Selv om en alder-avhengige nedgang i klatring aktiviteten tilknyttet neurodegeneration er beskrevet her, denne analysen er like effektive i å analysere locomotor aktivitet relevante utviklingsmessige feil. Dette er automatiserte RING analysen en nyttig og effektiv tilnærming for å analysere Drosophila negative geotaxis i noen voksne stadiet og enten vanlig eller patologisk delstaten hjernefunksjon. Likevel analysen har begrenset bruk i helt analysere alle fluer til tross for RflyDetection programvaren er evnen til å manuelt identifisere noen tilfeldigvis uncaptured seg.