فحص الآلي سريع جيوتاكسيس سلبية متكررة لتحليل سلوك التسلق الكبار في نموذج المورفولوجية نيوروديجينيريشن

وقد وضعت مجموعة متنوعة من بروتوكولات وأساليب لتحليل سلوك التسلق الكبار المورفولوجية . بل شاقة، التحليل التقليدي معظمها ينطوي على وضع ذبابة واحدة قنينة فردية ويستخدم قوة يدوية للاستفادة من الذباب إلى أسفل لمزامنة^1،2،3،4. هي شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً، وغير ملائمة للدراسات العالية الإنتاجية الكبيرة، والاختلافات المحتملة للقوة اليدوية المستخدمة للاستفادة من انخفاض الذباب، فضلا عن القيود الأخرى. تحسين المقايسة، وضعت مقايسة جيوتاكسيس سلبية تكرارية سريع (الدائري) الذي يسمح تحليل الفائق على مدى العديد من الذباب في الوقت نفسه⁵. بيد الفحص لا يزال يتطلب قوة ممارسة يدوياً لمزامنة العمل يطير. لدينا نسخة التحليل الدائري، نقحت بناء على التحليل السابق، يتضمن قاعدة معدنية لاستضافة عدة قنينات المحتوية على الطاير تلقائياً يسيطر عليها محرك كهربائي محرك تزامن يطير⁶. عند التسجيل، حلل الطاير تسلق فورا بعد أن يتم تسجيل المزامنة ثم استخدام برمجيات مصممة ذاتيا. لدينا المقايسة خاتم الآلي إلغاء عملية شاقة وتتطلب عمالة مكثفة في جمع البيانات من ذبابة واحدة، واحدة في كل مرة، وتمكين عملية الحصول على البيانات لتكون أكثر كفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت مقايسة خاتم الآلي في عدد من الدراسات توضيح الآلية الكامنة وراء مرض الزهايمر ومرض باركنسون، التحقق من صحة النهج مع كفاءة عالية^7،8،9 .

في هذه المقالة، نبدي المقايسة خاتم الآلي باستخدام DDC Gal4 مدفوعة [رني] الذباب. DDC-Gal4 خط Gal4 على وجه الخصوص معربا عن تتميز (دا) وهرمون السيروتونين من الخلايا العصبية، وبالتالي تمثل أداة عظيمة لتحليل تأثيرات الجينات المستهدفة المرتبطة بالعجز الحركي المرافقين نيوروديجينيريشن¹⁰. وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا إدراج UAS-Dicer2، خط الطيران الذي يعزز كفاءة [رني]، لتوليد UAS-Dicer2؛ DDC-Gal4 أداة الخط. [رني] الذباب نختار لاستخدام هو أوكسيلين (aux) v16182 [رني] (عازر¹⁶¹⁸²)، تطير جينات التي حددناها سابقا المعرض لها تأثير على النشاط الحركي⁸. أوكسجفب الذباب مستعدون أيضا لتحليل آثار aux overexpression. ونحن سوف تظهر كيفية استخدام التحليل الدائري الآلي لقياس يطير جيوتاكسيس السلبية وتقديم النتائج ومناقشة أي آثار تم الحصول عليها من النتائج.

1-"جمع يطير"

1. الحفاظ على الذباب على الطعام يطير القياسية في 25 درجة مئوية، والرطوبة 70%، ودائرة ضوء/الظلام ح 12/12 ح.
2. جمع UAS -Dicer2؛ DDC-GAL4 فيرجينسوندير يطير غاز ثاني أكسيد الكربون (CO ₂) التخدير.
3. عبور هذه العذارى للذباب الذكور البالغين 2 يوم من العمر يحمل الأنماط الوراثية التالية: UAS-mCD8GFP (المراقبة)، عازر ¹⁶¹⁸² (aux [رني]) ، أوكسجفب (aux overexpression)، و عازر ¹⁶¹⁸²؛ أوكسجفب (الإنقاذ)، مع الذكور: الإناث نسبة 1:2.
4. بشكل منفصل جمع حديثا اكلوسيد الذكور والإناث في قنينات 3 لكل مجموعة لكل تجربة، وضع الذباب 10 في كل قنينة الطيران العادية مع الغذاء القياسية في 25 درجة مئوية.
5. اعتماداً على التجربة، الاحتفاظ جمع الذباب تصل إلى 35 يوما واستخدامها لتحليل الحلقة الآلي في يوم 5 و 15، 25 و 35-

2. الآلي المقايسة خاتم

1. 10 نقل الذباب المجمعة (الجنسين) في النمط الوراثي في كل فيال، ثم تأمين القنينة مع المسمار. تحليل مراقبة الذباب والذباب يحمل الأنماط الجينية المختلفة معا لكل مجموعة من التجارب (ما يصل إلى 10 زجاجة في نفس الوقت، الذباب 10 في كل قنينة).
2. تشغيل الكاميرا الرقمية التي توضع أمام الجهاز، وبدء تسجيل مرة واحدة الذباب جميع محملة وجاهزة-
3. بعد السماح 1 دقيقة للذباب لتسوية في قارورة، قم بتشغيل وحدة تحكم الخطوة التي يتحكم السائق خطوة؛ وهذا يدفع محرك كهربائي صغير للتحكم في ذراع المرفقة حيث أن يرتفع تباعا وصنابير الجهاز 4 مرات في 2 ثانية. انظر الشكل 1.
   1. بعد التنصت، علما أن الذباب تبدأ بالصعود الجدار. ضمان استمرار تسجيل.
4. تكرار التزامن كما هو موضح في الخطوة 2.3 في الفاصل الزمني 60-s للمحاكمات على التوالي 3 إلى 5-
5. كرر التجربة 5، 15، 25، والذباب 35 يوم من العمر. إجراء تجارب مستقلة على الأقل 3 لكل مجموعة، وكل تجربة مع مالا يقل عن 30 المجمعة الذباب (3 قنينات).

3. تحليل بيانات

1. استيراد الفيديو المسجلة إلى الكمبيوتر-
2. أخذ لقطة من الفيديو في 6 s بعد التنصت، لكل محاكمة.
3. استيراد الصورة اللقطة إلى البرنامج رفليديتيكتيون (انظر الشكل 2)، باستخدام ' ملف ' القائمة.
4. تعيين خطوط الأساس العلوي والسفلي من القنينة تحديداً باستخدام رمز خط على شريط الأدوات، ثم استخدام المؤشر لوضع علامة على خطوط الأساس العلوي والسفلي في الصورة-
5. إدخال عدد الذباب كل قنينة (مثلاً، 10 هنا) في ' الذباب في المستطيل ' طول الحقل والقنينة (مثلاً، هنا 14 سم) في ' "ارتفاع أنبوب" ' الميدانية داخل شريط الإعدادات.
   1. علما بأن المواقف يطير الفردية التي تم الكشف عنها والمسمى بالنقاط على الشاشة لكل قنينة.
      ملاحظة: يشير الرقم 2 إلى مواقف جميع نقرات زر القائمة-
6. علما بأن البرنامج يحدد مسافة التسلق لكل ذبابة تلقائياً ويعرض القيم متوسط من الذباب 10 في كل قنينة في جدول على اللوحة اليمنى. (انظر الشكل 2)
7. عملية عدد التسلق مع البرامج الإحصائية (مثلاً، المنشور) لمزيد من التحليل الإحصائي-
8. هذا يعني البيانات ك ± sem.
9. حساب فقيم ذات أهمية (يشار إليه بعلامات نجمية، * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001) استخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع بونفيروني متعددة مقارنة test.

يوضح هذا المقال استخدام مقايسة خاتم الآلي في تقييم سلوك الذبابة جيوتاكسيس السلبية. خلافا للمقايسة الحلقة السابقة، يتضمن المقايسة لدينا جهاز الآلي الذي يوفر قوة كهربائية لمزامنة العمل يطير ويحلل تصل إلى مئات ذباب في وقت واحد (الشكل 1). تحليل Dicer2 ؛ DDC > عازر¹⁶¹⁸² أظهرت الذباب انخفاض العمر تعتمد على مسافة التسلق في غضون فترة زمنية 6-s للذباب الذكور والإناث على حد سواء، مما يوحي بأن التعبير aux في الخلايا العصبية دا أمر بالغ الأهمية للنشاط الحركي يطير. تسلق قدرة لا يبدو أن تتأثر عند أوفيريكسبريشن أوكسجفب في الخلايا العصبية دا، وانقذت التعبير المشارك عازر¹⁶¹⁸² و أوكسجفب في الخلايا العصبية دا النمط الظاهري [رني] (الشكل 2 و الشكل 3). بالإضافة إلى التحقق من صحة التحليل الدائري الآلي كنهج الفائق والكفاءة لتقييم السيارات العيوب المرتبطة بانحطاط العصبية دا، تشير هذه النتائج أيضا إلى أن هذا النهج الآلي مفيد في تحديد إمكانات عوامل خطر مرض باركنسون ويقدم فكرة عن وظيفتها الأعصاب.

رقم 1. جهاز رنين الآلي. (أ و ب) الجبهة ووجهات النظر الخلفي للجهاز: المقبس (1)، وقضبان الصلب العمودية (2)، والمسمار لتأمين الأنبوبة على الإطار (3)، قارورة من البلاستيك الشفاف (4)، والرغوة بار (5)، والقاعدة المعدنية (6)، برنامج التشغيل الجزئي-الخطوة (7)، وحدة التحكم الإلكترونية (8)، التبديل (9) والسيارات الكهربائية الصغيرة (10)، ورافعة يعلق على المحركات الكهربائية الصغيرة (11). حجم إطار معدني مستطيل 46 سم × 26 سم × 16 سم، عقد 10 شفافة قارورة من البلاستيك (2.1 سم في القطر، 14.5 سم في الطول) المضمون مع مسامير. لتشغيل الجهاز، انقر أولاً على التبديل (9)، الذي يتحول في (8)، (7)، و (10) وبناء على ذلك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2. تحليل لممثل لقطة الصورة عن طريق رفليديتيكشن- يتم استيراد الصورة لقطة في البرنامج رفليديتيكشن ويرد الإجراء لكل رمز في التفاعل مع النص على الحق. بعد تحديد خطوط الأساس العلوي والسفلي، يكشف البرنامج تلقائياً ويمثل الموقف الذي يطير داخل القنينة. مسافة التسلق (سم) في 6 s لكل الطيران ومتوسط القيم لكل قنينة يتم عرضها في جدول. ثم يتم استيراد هذه الأرقام إلى البرامج الإحصائية للحصول على مزيد من التحليل الإحصائي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3. شريط الرسوم البيانية الإحصائية تبين حدوث انخفاض تعتمد على العمر في الطيران قدرة التسلق عندما يكون التعبير aux دوونريجولاتيد في الخلايا العصبية دا- استخدمت مقايسة خاتم الآلي لتحليل سلوك جيوتاكسيس السلبية للذباب يحمل الأنماط الوراثية التالية: عازر¹⁶¹⁸²/+ (لا Gal4)، UAS-Dicer2؛ DDC-Gal4 الذباب عبروا إلى w¹¹¹⁸ (تحكم) UAS-mCD8GFP (المراقبة) و عازر¹⁶¹⁸²، أوكسجفب، و عازر¹⁶¹⁸²؛ أوكسجفب (الإنقاذ). ملاحظة أن الذباب الذكور والإناث على حد سواء ارتفع إلى حد كبير أبطأ مع مرور الوقت عندما تم خفض التعبير aux في الخلايا العصبية دا. وتم إنقاذ حالات العجز الحركي عند إعادة التعبير aux . وقيمت الذباب من 5، 15 و 25 و 35 يوم من العمر. وترد بشكل منفصل ذكر (A) والإناث (ب) الذباب. أساطير مع تسميات الوراثي المقابلة لألوان مختلفة من شريط يرد على الحق. يتم عرض البيانات كما يعني ± sem. فقيم ذات أهمية (المبين بعلامات نجمية، * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < ns 0.001،: الانتباه لا أهمية له، بار أدناه العلامات النجمية للإشارة إلى الكائنات إلى مقارنة) حسبت مقارنة لعنصر التحكم mCD8GFP أو aux [رني] استخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع بونفيروني التجارب المقارنة متعددة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

مقايسة خاتم الآلي الموصوفة هنا يتيح تحليلاً الفائق للسلوك جيوتاكسيس السلبية يطير لمئات ذباب في وقت واحد. سابقا تنطوي الاستراتيجيات القائمة لتحليل تسلق الكبار ملاحظات ذبابة واحدة في قنينة فردية، والكشف عن موقف يطير يدوياً بواسطة العين. في بعض الأحيان قد يسبب هذه العملية شاقة بدلاً من قراءة خاطئة أو التفسير الخاطئ للبيانات، فضلا عن عمل كثيفة العمالة. لدينا المقايسة خاتم الآلي يبدأ بنقرة بسيطة، ومزامنة الجهاز تلقائياً، ويقيم قدرة التسلق من الذباب تصل إلى 100. تزامن الكهربائية يوفر وسيلة أكثر دقة لمراقبة الوقت وغيرها من المعالم، وحتى التقاط الشاملة للطيران التسلق الكبار عملية يمكن قياسها بدقة.

المقبل، مع برنامجنا رفليديتيكشن الذاتي المصممة، يمكن تحديد الموضع الدقيق يطير. يأخذ في منطقة قنينة النظر في 2D الشاملة (يحدده إطار مستطيل)، وخطوط الأساس العلوي والسفلي، قبل الحصول على مناصب لجميع الذباب داخل المنطقة المخصصة للبرنامج ويقدم لهم كنقاط. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح الحساب التلقائي لمسافة التسلق ومتوسط قيم التلاعب بالبيانات أسرع وأسهل. يمكن تجميع مجموعات البيانات عبر مجموعة كبيرة من الذباب معقول وتحليلها ضمن إطار زمني معقول^7،،من⁸⁹.

على الرغم من أن تعتمد على عمر انخفاض في نشاط التسلق المرتبطة نيوروديجينيريشن يرد هنا، هذا التحليل نفس القدر من الفعالية في تحليل النشاط الحركي العيوب الإنمائية ذات الصلة. وتحقيقا لهذه الغاية، مقايسة خاتم الآلي نهج مفيدة وفعالة لتحليل المورفولوجية جيوتاكسيس السلبية في أي مرحلة الكبار، وأما الدولة العادية أو المرضية لوظيفة الدماغ. ومع ذلك، محدودة المقايسة الاستخدام في تحليل جميع الذباب على الرغم من البرمجيات رفليديتيكشن تماما القدرة على تحديد أي يدوياً عن طريق الخطأ uncaptured منها.