Summary

Ein RANKL-basierte Osteoklasten Kultur Assay der Maus Knochenmark zu untersuchen, die Rolle von mTORC1 in Osteoklasten Bildung

Published: March 15, 2018
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Summary

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zum isolieren und Kultur Osteoklasten in Vitro aus Maus Knochenmark und zur Untersuchung der Rolle von Säugetieren/mechanistischen Ziel von Rapamycin Komplex 1 in Osteoklasten-Formation.

Abstract

Osteoklasten sind einzigartige Knochen-resorbierbarem Zellen, die von der Monocyte/Makrophagen-Linie des Knochenmarks zu unterscheiden. Dysfunktion von Osteoklasten kann eine Reihe von metabolischen Knochenerkrankungen wie Osteoporose führen. Um pharmazeutische Ziele für die Vermeidung von krankhaften Knochenschwund Masse zu entwickeln, müssen die Mechanismen, durch die Osteoklasten aus Vorstufen unterscheiden, verstanden werden. Die Fähigkeit zu isolieren und eine große Anzahl von Osteoklasten in-vitro- Kultur ist entscheidend, um die Rolle bestimmter Gene in Osteoklasten Differenzierung bestimmen. Inaktivierung von Säugetieren/mechanistischen Ziel von Rapamycin Komplex 1 (TORC1) in Osteoklasten kann Osteoklasten Anzahl verringern und Knochenmasse zu erhöhen; jedoch bedürfen die zugrunde liegenden Mechanismen weiterer Untersuchungen. In der vorliegenden Studie wird ein RANKL-basiertes Protokoll zu isolieren und Kultur Osteoklasten aus Maus Knochenmark und Untersuchung des Einflusses von mTORC1 Inaktivierung auf Osteoklasten Formation beschrieben. Dieses Protokoll führte erfolgreich eine große Anzahl von riesigen Osteoklasten in der Regel innerhalb einer Woche. Löschen von Raptor beeinträchtigt Osteoklasten Bildung und nahm die Aktivität des sekretorischen Tartrat-resistente saure Phosphatase, anzeigend, dass mTORC1 für Osteoklasten Bildung entscheidend.

Introduction

Knochen ist ein ständig wechselnden Organ und wird von Osteoblasten und Osteoklasten zeitlebens umgebaut. Osteoklasten sind verantwortlich für mineralisierten Matrix Resorption und Osteoblasten zu synthetisieren und sezernieren neue Knochen Matrizen1. Die Balance zwischen Knochenabbau und Knochenaufbau ist entscheidend für die Knochengesundheit, einschließlich der Wartung der Knochen Masse und Reaktion auf Stimulation und Verletzungen. Wenn dieses Gleichgewicht gestört ist, kann eine Reihe von metabolischen Knochenerkrankungen wie Osteoporose und parodontale Erkrankungen auftreten. Bei diesen Erkrankungen übersteigt Knochen Masse Verlust infolge osteoclastic Knochenabbau Knochen bilden Kapazität von Osteoblasten2,3. So um pharmazeutische Ziele zur Behandlung von Skeletterkrankungen wie Osteoporose zu entwickeln, ist es wichtig zu verstehen, die Erzeugung und die Biologie der Osteoklasten4.

Osteoklasten sind einzigartige mehrkernigen Riesenzellen befindet sich an oder nahe der Knochenoberfläche und gehören zu der Familie Monocyte/Makrophagen-1. Ibbotson K. J. Et al. eine Methode zur Erzeugung Osteoklasten-wie Zellen in Vitro mit 1,25-Dihydroxy-Vitamin D35-haltigem Medium berichtet. Die Identifizierung von Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator für nukleare Faktor κ B Ligand (RANKL) als wesentliche Faktoren der Osteoklasten Bildung hat dramatisch zugenommen, die Effizienz der Osteoclastogenesis in vitro 1 , 6 , 7. die Möglichkeit, Kultur Osteoklasten in Vitro hat unser Verständnis der Generation und Regulierung der Osteoklasten verbessert.

Das Säugetier/mechanistischen Ziel von Rapamycin (mTOR) Funktionen in zwei strukturell und funktionell unterschiedliche komplexe, nämlich mTORC1 und mTORC28,9. Die zwei Multi-Protein-komplexe sind aufgrund ihrer unterschiedlichen Komponenten und nachgelagerten Substrate voneinander. mTORC1 enthält das einzigartige regulatorischen-assoziierten Protein mTOR (Raptor), während mTORC2 Rapamycin-unempfindliche Begleiter von mTOR (Rictor)9enthält. mTORC1 können integrieren und übertragen wichtige Signale, Zellwachstum, Proliferation und Differenzierung zu regulieren. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass diese mTORC1 spielt eine Schlüsselrolle im Netzwerk der katabolen Knochenabbau durch Löschen des Raptor , mTORC1 in Osteoklasten10zu inaktivieren. Jedoch bedürfen die zugrunde liegenden Mechanismen weiterer Untersuchungen. In der vorliegenden Studie wurde eine Osteoclastogenic RANKL-basierte Methode Osteoklasten aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs) der Wildtyp (WT) und RapCtsk Mäuse zu generieren und Untersuchung des Einflusses von mTORC1 Inaktivierung auf Osteoklasten verwendet. Bildung.

Protocol

Alle Verfahren in Bezug auf die Tiere wurden nach dem Protokoll von der Stanford-Verwaltungs-Panel auf Laboratory Animal Care (APLAC) genehmigt durchgeführt und wurden durch die Animal Care and Use Committee des Shanghai Institute für Biochemie und Zelle genehmigt Biologie. 1. Vorbereitung Generieren von Osteoklasten bestimmte Raptor Löschung Mäuse (Raptorfl/fl; Ctsk-Cre, jenseits CtskRap) bei der Paarung Raptorfl…

Representative Results

Mit Hilfe dieses Protokolls, wurden eine große Anzahl von riesigen Osteoklasten am 6. Tag gesehen; Wenn riesige Osteoklasten nicht gesehen werden, möglicherweise einen weiteren Tag der Osteoklasten Differenzierung benötigt (Abbildung 1). Erfolgreiche Osteoklasten Bildung bestätigte Falle Färbung (Abbildung 2A). Osteoklasten waren Wein rot/violett Riesenzellen mit mehr als 3 Kerne. Mehr als 250 Osteoklasten wurden in jede Ver…

Discussion

Die Osteoclastogenic-Assay ist die am weitesten verbreitete Methode zur Isolierung und Kultur Osteoklasten in-vitro-12,13. Während mehrere RANKL-basierte Osteoklasten Induktionen beschrieben13,14,15gewesen sein, beschrieben die vorliegende Studie ein Protokoll mit einigen Änderungen basierend auf den bisherigen Methoden.

In der vora…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Dr. Minghan Tong und S. Kato für freundlicherweise die Reagenzien und Mäuse. Wir danken die Mitgliedern des Zou Lab für nützliche Diskussionen. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch Zuschüsse von 973-Programm aus dem chinesischen Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST) [2014CB964704 und 2015CB964503], klinische Forschungsprogramm des 9. Volks Krankenhaus, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Danke für die Hilfe von Core Facility für Zellbiologie und Core Facility für chemische Biologie, CAS Zentrum für Exzellenz in der molekularen Zelle Wissenschaft, Shanghai Institut für Biochemie und Zellbiologie, Chinese Academy of Sciences.

Materials

Raptorfl/fl mice The Jackson Laboratory 013188
Ctsk-cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
α-MEM Corning 10-022-CVR
Glutamine Gibico 25030081
Penicillin streptomycin Gibico 15140122
Fetal calf serum BioInd 04-001-1A
Recombinant mouse M-CSF protein R&D Q3U4F9
Recombinant mouse RANKL protein R&D Q3TWY5
RBC lysis buffer Beyotime C3702
Trypan blue Sigma-Aldrich 302643
Acetone Shanghai Chemical Co. Ltd.
Citrate solution Sigma-Aldrich 915
Formaldehyde solution Shanghai Chemical Co. Ltd.
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT
Fast Garnet GBC Base solution Sigma-Aldrich 3872
Sodium Nitrite Solution Sigma-Aldrich 914
Naphthol AS-BI Phosphate Solution Sigma-Aldrich 3871
Acetate solution Sigma-Aldrich 3863
Tartrate solution Sigma-Aldrich 3873
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CVR
L-tartaric acid Sigma-Aldrich 251380
Sodium tartrate dibasic dehydrate Sigma-Aldrich s4797
Glycine Shanghai Chemical Co. Ltd.
MgCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOH Shanghai Chemical Co. Ltd.
Phosphatase substrate Sigma-Aldrich P4744
anti-Raptor Cell Signaling Technology 2280
anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) Cell Signaling Technology 2317
anti-ribosomal protein S6 Cell Signaling Technology 2211
anti-β-actin Santa Cruz Biotechnology sc-130300
37% formaldehyde Xilong scientific
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane Bio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Millipore 00000367MSDS
IX71 Olympus
Envision Perkin Elmer
0.45-mm Syringe
Scissor
Mosquito forcep

Referências

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Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).

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