Metodo del tubo rullo modificate per Imaging intermittente precisamente localizzata e ripetitivi durante la coltura a lungo termine delle fette di cervello in un sistema chiuso

Colture primarie di neuroni dissociati dalle regioni del cervello del roditore sono un importante strumento usato dai ricercatori per osservare le risposte alla patologico implicato stimoli. Tuttavia, tali studi hanno lo svantaggio di guardando i neuroni in 2D solo e senza loro glial sistema di supporto. Inoltre, a meno che non coltivate in condizioni di densità molto alta (640 neuroni/mm² o circa il 16% della superficie) in cui esso diventa impossibile seguire la conseguenza casuale di un dendrite o assone per più di una breve distanza dal suo corpo cellulare, hippocampal vitalità neuronale oltre 4 settimane diminuisce significativamente¹, limitando l’uso di colture dissociate per gli studi estesi delle patologie età-correlate. Alla coltura delle fette preparati dal cervello del roditore è un’opzione attraente che supera queste limitazioni mantenendo un’architettura cellulare organizzata e vitalità per settimane o mesi. Condizioni per il mantenimento di molte regioni differenti del cervello del roditore nella fetta di cultura sono stati descritti².

Due metodi principali sono ampiamente usati per la coltura a lungo termine di fette del cervello: coltura su membrane all’ interfaccia aria-liquido³ o coltura sulle lamelle in provette sigillate permesso di ruotare in un incubatore a rullo per fornire aerazione⁴. Fette coltivate sulle membrane possono essere imaged direttamente con microscopia di fluorescenza ad alta risoluzione utilizzando un microscopio dritto e acqua immersione obiettivi⁵. In alternativa, fette coltivate sulle membrane sono stati trasferiti a piatti di fondo di vetro per ottenere una buona risoluzione delle spine dendritiche usando un microscopio invertito⁶. Tuttavia, entrambi i metodi di imaging fette coltivate sulle membrane sono sistemi aperti che richiedono modifiche medie e spesso utilizzano antimicotico e/o antibiotici per prevenire o ridurre la contaminazione^5,6. Fette su una membrana all’interfaccia aria-medio mantengono eccellente morfologia e sopravvivenza, ma tornando a posizioni precise durante la formazione immagine ripetitiva ad alto ingrandimento è estremamente difficile a meno che l’esperimento è seguito solo piccoli gruppi di cellule esprimendo un marcatore fluorescente. Sebbene fette coltivate sulle membrane sono stati utilizzati con espressione virale-mediata di transgeni^5,6, protocolli di biosicurezza potrebbero richiedere un sistema di coltura chiuso essere impiegato per alcuni vettori virali che sono utilizzati per esprimendo la fluorescente tagged proteine e reporter di fisiologia cellulare. Inoltre, obiettivi di immersione richiedono una decontaminazione tra i campioni che verranno seguite nella cultura⁵. Una delle principale applicazioni del culture interfaccia membrana sta combinando imaging ad alta risoluzione con elettrofisiologia a singola volta punti⁷.

Il metodo del tubo rullo con lamelle all’interno del tubo di plastica non consente alcun elettrofisiologia o imaging ad alta risoluzione senza rimuovere il vetrino coprioggetti. Pertanto, questo metodo è stato applicato più spesso a studi a lungo termine in cui sono state fatte osservazioni post-fissazione,⁸. Qui descritto è un metodo che utilizza la tecnica della coltura tubo rullo ma sui tubi forati-out con fette sulle lamelle che possono essere imaged in modo ripetitivo per finchè le culture vengono mantenuto. Il sistema chiuso non richiede alcun cambiamento medio per l’imaging e utilizza vetrini coprioggetti fotoincisioni per fornire fiducial marchi che consentono di imaging ad alto ingrandimento, dopo giorni o settimane, i precisi campi precedentemente imaged.

Applichiamo questo metodo per esaminare i cambiamenti nel roditore ippocampo, una regione del cervello più importanti coinvolta nella memoria e l’apprendimento. L’ippocampo roditore è spesso studiata come un modello per patologiche o età-correlate cambiamenti osservati durante lo sviluppo di danno conoscitivo⁹, come quelle che si verificano in annuncio. Il nostro metodo è particolarmente adatto per studiare i cambiamenti patologici che si sviluppano all’interno di una singola fetta nel tempo in risposta ai cambiamenti ambientali, come aumenti di peptidi Aβ, che è caratteristica della AD⁸. Una patologia connessa con il cervello umano e del roditore dell’annuncio è la presenza di aggregati cofilina-actina e le bacchette, quest’ultimi contiene fasci di filamenti in cui cofilina e actina sono presenti un 1:1 rapporto molare^{10,11, 12}. canne sono state osservate in fisse fette dell’ippocampo del ratto dopo il trattamento di Aβ, così come all’interno di una fetta di cervello del roditore vivo esprimendo cofilina-GFP sottoposti ad ipossia⁸, e possono contribuire alla disfunzione sinaptica ad esempio ad e di colpo. Qui usiamo questo nuovo metodo di coltura per osservare il decorso e la distribuzione all’interno di fette di proteine fluorescenti chimeriche esogene espresse introdotte da virus diversi. Utilizziamo quindi l’espressione specifica di un neurone di un costrutto di reporter cofilina di seguire lo sviluppo della cofilina rod e aggregata patologia nelle fette hippocampal in risposta al trattamento con oligomeri solubili di Aβ (Aβ_o).