Nós descrevemos um método para a localização de guiada por estereotaxia, exposição e ablação do córtex auditivo em ratos. A localização da ablação é avaliada utilizando uma autópsia de coordenadas de mapa.
O córtex auditivo de ratos (AC) está se tornando popular entre investigadores de neurociência auditivo que estão interessados na plasticidade de experiência-dependência, processos de percepção auditivos e controle cortical de processamento nos núcleos auditivos subcorticais de som. Para enfrentar novos desafios, um procedimento para localizar com precisão e cirurgicamente expor o córtex auditivo aceleraria esse esforço de investigação. Neurocirurgia estereotáxica é usada rotineiramente na investigação pré-clínicos em modelos animais para engraft uma agulha ou um eletrodo em um local pré-definido dentro do córtex auditivo. O seguinte protocolo, usamos métodos estereotáxico em uma forma nova. Podemos identificar quatro pontos de coordenadas sobre a superfície da temporal bone do rato para definir uma janela que, uma vez aberto, expõe com precisão tanto o primário (A1) e secundário (Dorsal e Ventral) córtices do AC, usando esse método, em seguida, executamos um cirúrgico ablação do AC. Depois de uma manipulação tão é executada, é necessário avaliar a localização, tamanho e extensão das lesões feitas no córtex. Assim, podemos também descrever um método para localizar facilmente a autópsia de ablação AC usando um mapa de coordenadas construído transferindo os limites de cytoarchitectural do AC para a superfície do cérebro. A combinação da localização guiada por estereotaxia e ablação do AC com a localização da área lesada em uma autópsia mapa coordenadas facilita a validação das informações provenientes do animal e leva a uma melhor análise e compreensão dos dados.
O rato é um dos mais utilizados modelos animais em Neurociências auditiva. A robustez do seu comportamento torna-o capaz de trabalhar por centenas de ensaios por dia. Sua sensibilidade e acuidade espectral para audição1,2e a organização anatômica e funcional do seu sistema central, comparável de outros mamíferos3, fazem o rato um modelo animal adequado para analisar uma ampla gama de Tópicos de pesquisa em neurociência auditivo. O córtex auditivo de ratos (AC), em particular, tem sido objecto de vários estudos anatômicos e fisiológicos que tentaram compreender sua estrutura, organização e papel no processamento de som3. Hoje em dia, o AC tornou-se popular entre os neurocientistas interessados na plasticidade de experiência-dependência, percepção auditiva, a base sináptica da organização do campo receptivo e o controle cortical do processamento de som no subcortical auditivo núcleos4,5,6,7,8,9. Para enfrentar os desafios que representam estas novas abordagens, procedimentos que podem localizar com precisão e expor cirurgicamente o AC vão acelerar os esforços de investigação. Técnicas estereotáxica facilitam a localizar regiões específicas dentro do cérebro sem testes de fisiologia. Embora o tamanho do cérebro varia ligeiramente entre os animais, a localização de qualquer área do cérebro pode ser determinada usando coordenadas estereotáxica conjunto de marcos históricos no crânio de cérebro de ratos.
A ablação restrita do AC é a remoção cirúrgica da região sensorial do córtex mais directamente relacionado com a audição. Em contraste com outros métodos usados para bloquear a atividade do AC, como refrigeração ou locais lidocaína injeções10,11,12, a ablação cirúrgica dos resultados AC na perda crônica de função. Assim, ablações de AC são mais adequadas para estudar os efeitos a longo prazo da privação cortical, bem como os fenômenos subsequentes da plasticidade da lesão. A combinação de métodos estereotáxica com ablações cirúrgicas do AC tem sido usado com sucesso para estudar os efeitos fisiológicos, comportamentais e moleculares de controle cortical privação13,14,15 ,16,17,18,19. Por exemplo, um modelo do rato com bilaterais ablações AC serviu para estudar os efeitos da ablação cortical no reflexo de alarme auditivo e tronco cerebral auditivo respostas (ABR)16. Recentemente, comparamos os efeitos tão unilaterais contra ablações bilaterais da produção rato AC em limiares ABR, amplitudes e latências em pontos diferentes de tempo após a lesão de18. Além disso, o modelo do rato de ablação de AC restritiva também tem sido usado para estudar o efeito de degeneração de caminho corticofugal no collicus inferior13,14,15 e o ouvido interno17 ,19. Depois que tal uma manipulação é realizada no cérebro, é necessário avaliar a localização, tamanho e extensão das lesões feitas no córtex. Embora muito útil, a principal limitação dos mapas de tonotopic com base em respostas neuronal20,21 são as técnicas eletrofisiológicas necessárias para localizar os campos auditivos no cérebro de ratos. Uma vez que nem todos os laboratórios têm o equipamento necessário e/ou experiência para fazer essas gravações, nós construímos o mapa coordenado com base na transferência dos limites cytoarchitectural do AC para uma imagem do cérebro de superfície18. Este mapa pode ser muito útil para localizar o AC sem testes de fisiologia.
O presente protocolo descreve um método para a localização de Estereotaxia guiada, exposição cirúrgica e ablação do AC em ratos. Ele também descreve como usar o nosso mapa coordenadas18 para localizar facilmente a extensão da lesão sobre uma foto da superfície dos cérebros ablated.
Uma cirurgia bem sucedida depende em cima de dois fatores: manter o animal vivo durante e após o procedimento e localizar com precisão a área de interesse. Garantindo que o rato é profundamente anestesiado durante a cirurgia (teste do reflexo de retirada) e recebe adequados analgésicos e antibióticos ototóxicos-não devem ajudar a sobrevivência. Além disso, o rato deve ser mantido em uma almofada de aquecimento até acorda da anestesia para evitar a hipotermia. Sutura irá diminuir a susceptibilidade à infecção, e uma técnica adequada é vital: animais vão pegar em seus clipes de ferida, então eles devem ser implantados firme o suficiente para impedir a remoção sem colocar muita tensão na ferida.
Para localizar com precisão o AC (ou qualquer outra área cortical), é importante determinar a posição de bregma, lambda e 0 interaural para usá-los como referências para calcular os limites da região alvo. Qualquer erro no cálculo as coordenadas resultará na ablação parcial de AC ou a aspiração indesejada de outras áreas circundantes. Assim, a ponta da agulha deve apenas tocar o osso em interaural 0 e em seguida traduzir as coordenadas antero-posterior e medio-lateral, de acordo com o que está descrito neste protocolo.
Neste manuscrito, também descrevemos como cirurgicamente expor e ablate o AC. Há três etapas essenciais: o processo de perfuração, a abertura e remoção das meninges e a ablação por aspiração. De perfuração deve ser realizada a baixa velocidade com pressão mínima, como uma perfuração de alta velocidade gera calor que pode afetar nas proximidades de estruturas subcorticais. No entanto, manter uma velocidade baixa e resfriamento da área de perfuração com soro fisiológico frio devem impedir qualquer dano. Além disso, a pressão mínima é essencial para evitar uma ruptura repentina do crânio e lesões subsequentes ao córtex subjacente. A abertura e remoção das meninges que cobrem o AC devem ser realizadas com cuidado para evitar a interrupção dos vasos sanguíneos. Se o sangramento ocorre, o diagnóstico precoce e tardia é geralmente desfavorável e é questionável se um animal satisfaz os critérios de inclusão para um estudo confiável. Neste caso recomendamos a eutanásia. Finalmente, a aspiração (provavelmente o aspecto mais difícil na realização de uma efetiva lesão), deve ser restrito a matéria cinzenta. Há dois indicadores que podem ajudar a detectar a presença de matéria branca: (1) uma mudança no contraste de cor, como a substância branca é mais brilhante do que a matéria cinzenta; e (2) a cessação do sangramento das artérias perfurantes.
Após qualquer manipulação realizada no cérebro, é necessário avaliar a localização, tamanho e extensão do procedimento feito no córtex para posterior análise e validação de dados provenientes do animal. Neste manuscrito, detalhamos como localizar a ablação realizada no córtex, usando um mapa de coordenadas descrito anteriormente pelo nosso grupo de18. Este mapa foi construído usando referências anatómicas obtidas reconstruções serial seção de cortes histológicos, correlacionados com o atlas Paxinos e Watson do rato cérebro22. Nesse sentido, o mapa diferencia-se entre o primário (A1) e córtices secundários (Dorsal e Ventral) do AC. A principal vantagem deste mapa coordenadas é que permite a rápida localização da lesão sobrepondo uma foto tirada da superfície lateral do cérebro colocado numa matriz sagital do cérebro. Outra vantagem é que laboratórios com menos experiência em anatomia podem usar o mapa pela adaptação ao seus modelos animais. Só é necessário definir as distâncias entre bregma, lambda e interaural 0 referências em um cérebro de controle perfundido e escala o mapa para cima ou para baixo em conformidade. Use a fissura Rhinal como referência para ajustar as imagens do cérebro para o mapa. A profundidade da ablação não pode ser determinada neste mapa coordenadas, então deve ser determinado em secções histológicas de cérebro.
A combinação de métodos estereotáxica com a exposição cirúrgica do AC são métodos básicos que poderiam facilmente ser adaptados por qualquer pesquisador que deseja direcionar o AC no rato. Isto pode ser para um experimento agudo ou que requer a implantação de dispositivos permanentes. Além disso, a ablação cirúrgica do AC anteriormente serviu como modelo para estudar os efeitos da privação crônica de cortical em audiência. Ablações AC também poderiam ser usadas para estudar os efeitos que unilateral ablações AC exercem em outras áreas corticais, ou servem como um modelo de acidente vascular cerebral. Assim, os projetos experimentais descritos aqui são métodos úteis que podem ser aplicados individualmente ou em combinação para uma ampla gama de projetos experimentais.
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi apoiada por uma concessão do Ministério da economia e competitividade (MINECO) do governo de Espanha, SAF2016-78898-C2-2-r..
Stereotaxic frame | David Kopf Ins. | 900 | |
Surgical microscope | WILD M650 Heerbrugg | ||
Heating pad | DAGA | ||
Dental micromotor | W&H elco | 5118 | |
Diamond burr | B Braun | GD021R | 0.6 mm |
Surgical suction device | Atmos | Atmoforte E2 | |
Ketamine | Merial | 30 mg/kg | |
Xylazine | Bayer | 5 mg/kg | |
Micromanipulator | Narishige | SM-11 | |
Scalpel | Lawton | ||
Povidone iodine | Meda | Betadine | |
sterile saline serum | B.Braun | ||
20G sterile needle | Terumo Neolus | ||
Cotton tips | |||
Suture material | B.Braun | ||
Antibiotic Ointment | Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) – Schering-Plough | ||
Forceps | dimeda | 10.331.12 | |
Surgical needles | World Precision Instruments | 501940 | |
Buprenorphine | Indivior UK | Buprex | 0.01-0.05 mg/kg |
Scissor | dimeda | 08.120.15 | |
Spencer scissor | dimeda | 08.804.14 | |
Rongeurs | Lawton | ||
Microsurgical knife | MSP | 7503 | |
Absorbable hemostatic gauze | Surgicel | ||
Saggital rat Brain Matrix | Activational systems Inc. | RBM-1000DV / RBM 4000C | |
Sodium pentobarbital | Vetoquinol | 0.1 mL | |
Camera | Olympus 5.1 MP | C-5060 wide zoom | lens F2.8-4.8 |
Wound clips | Reflex 9 | 9 mm | |
Canvas 12 | ACD Systems | ||
needle gauge | diameter 1.8 mm | ||
Separatory funnel | labbox | 11409 | 500 mL |
GluA2 primer Forward | GeneBank | NM_017261 | CGGCAGCTCAGCTAAAAACT |
GluA2 primer Reverse | GeneBank | NM_017261 | TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA |
GluA3 primer Forward | GeneBank | NM_032990 | ATTGCTGATGGTGCAATGAC |
GluA3 primer Reverse | GeneBank | NM_032990 | TTTGCATTGTCGCAAGTCTC |