Se describe un método para la ubicación stereotactically-dirigida, la exposición y la ablación de la corteza auditiva de ratas. La localización de la ablación se evaluó mediante post mortem de un mapa de coordenadas.
La corteza auditiva de ratas (AC) se está convirtiendo en popular entre los investigadores de Neurociencia auditiva que están interesados en la plasticidad de la dependencia de la experiencia y procesos perceptivos auditivos cortical control de procesamiento en los núcleos auditivos subcorticales de sonido. Para hacer frente a nuevos retos, un procedimiento para localizar con precisión y quirúrgico exponer la corteza auditiva agilizaría este esfuerzo de investigación. Neurocirugía estereotáxica se utiliza rutinariamente en la investigación preclínica en modelos animales al engraft una aguja o electrodo en un lugar previamente definido dentro de la corteza auditiva. En el siguiente protocolo, utilizamos métodos estereotácticos de una forma novedosa. Identificamos cuatro puntos de coordenadas sobre la superficie de la temporal bone de la rata para definir una ventana que, una vez abierto, expone con precisión tanto el principal (A1) y secundaria (Dorsal y Ventral) cortezas de la A.C. con este método, entonces realizamos una cirugía ablación de la CA. Después de realiza dicha manipulación, es necesario evaluar la localización, tamaño y extensión de las lesiones en la corteza. Así, describimos un método para localizar fácilmente la autopsia de la ablación de la AC utilizando un mapa de coordenadas construido mediante la transferencia de los límites citoarquitectónicos de la CA a la superficie del cerebro. La combinación de la localización stereotactically dirigido y ablación de la CA con la localización de la zona lesionada en post mortem de un mapa de coordenadas facilita la validación de la información obtenida de los animales y conduce a un mejor análisis y comprensión de los datos.
La rata es uno de los modelos animales más utilizados en Neurología auditiva. La robustez de su comportamiento, es capaz de trabajar a cientos de ensayos por día. Su sensibilidad y agudeza espectral audiencia1,2, y la organización anatómica y funcional de su sistema central, comparable de otros mamíferos3, hacen la rata en un modelo animal adecuado para el análisis de una amplia gama de temas de investigación en Neurociencia auditiva. La corteza auditiva de ratas (AC), en particular, ha sido objeto de varios estudios anatómicos y fisiológicos que han tratado de comprender su estructura, organización y papel en el procesamiento de sonido3. Hoy en día, la AC se ha vuelto popular entre los neurólogos interesados en la plasticidad de la dependencia de la experiencia, percepción auditiva, la base sináptica de la organización del campo receptivo y el control cortical del procesamiento del sonido en el subcortical auditivo 5,4,6,7,de núcleos de8,9. Para abordar los desafíos que plantean estos nuevos enfoques, procedimientos que se pueden localizar con precisión y exponer quirúrgicamente la CA acelerará los esfuerzos de investigación. Técnicas estereotácticas permiten localizar regiones específicas en el cerebro sin pruebas de Fisiología. Aunque el tamaño del cerebro varía ligeramente entre los animales, la ubicación de cualquier área del cerebro puede ser determinada utilizando coordenadas stereotactic conjunto de hitos en el cráneo del cerebro de rata.
La ablación restringida de la AC es la extirpación quirúrgica de la región sensorial de la corteza más directamente relacionada con la audiencia. En contraste con otros métodos utilizados para bloquear la actividad de AC, tales como refrigeración o local lidocaína inyecciones10,11,12, la ablación quirúrgica de los resultados de AC en la pérdida crónica de la función. Así, ablaciones de AC son más adecuados para estudiar los efectos a largo plazo de privación cortical, así como los posteriores fenómenos de plasticidad de la lesión. La combinación de métodos estereotácticas con ablación quirúrgica de la CA se ha utilizado con éxito para estudiar los efectos fisiológicos, conductuales y moleculares de control cortical privación13,14,15 ,16,17,18,19. Por ejemplo, un modelo de rata con ablaciones bilaterales de AC se ha utilizado para estudiar los efectos de la ablación cortical en el reflejo de sobresalto auditivo y auditivas del médula oblonga (ABR) de respuestas16. Recientemente, hemos comparado los efectos que unilateral versus bilaterales ablaciones de los productos de rata AC en los umbrales de la ABR, amplitudes y latencias en diferentes momentos después de la lesión18. Además, el modelo de la rata de ablación AC restrictiva también se ha utilizado para estudiar el efecto de la degeneración vía corticofugal en la inferior collicus13,14,15 y el oído interno17 ,19. Después de que tal manipulación se realiza en el cerebro, es necesario evaluar la localización, tamaño y extensión de las lesiones en la corteza. Aunque muy útiles, la principal limitación de tonotópica mapas basados en las respuestas neuronales20,21 son las técnicas electrofisiológicas necesarias para localizar los campos auditivos en el cerebro de la rata. Puesto que no todos los laboratorios tienen el equipo necesario o conocimientos para hacer tales grabaciones, se construyó un mapa de coordenadas basado en la transferencia de los límites citoarquitectónicos de la CA a una imagen de la superficie del cerebro18. Este mapa puede ser muy útil para localizar la CA sin pruebas de Fisiología.
El presente Protocolo describe un método para la ubicación stereotactically guiada, exposición quirúrgica y ablación de la CA en ratas. También describe cómo utilizar nuestro mapa coordenadas18 para fácilmente localizar la extensión de la lesión sobre una imagen de la superficie de los cerebros seccionados.
Una cirugía exitosa depende dos factores: mantener vivo al animal durante y después del procedimiento y localizar con precisión el área de interés. Asegurar que la rata es profundamente anestesiada durante la cirugía (prueba el reflejo de retirada) y recibe suficientes analgésicos y antibióticos no ototóxicos deben ayudar a la supervivencia. Además, la rata se debe mantener sobre una almohada hasta que despierta de la anestesia para evitar la hipotermia. Sutura se reduce la susceptibilidad a la infección, y la técnica adecuada es de vital importancia: animales elegirá a sus clips de herida, por lo que debería ser implantados lo suficientemente apretado para evitar la remoción sin poner demasiada tensión en la herida.
Para localizar con precisión el AC (o cualquier otra área cortical), es importante determinar la posición de bregma y lambda 0 interaural para utilizarlos como referencias para el cálculo de los límites de la región específica. Cualquier error en el cálculo de las coordenadas resultará en la ablación parcial de la CA o la aspiración no deseada de otras zonas aledañas. Así, la punta de la aguja debe solamente toque el hueso 0 interaural y luego traducir las coordenadas anteroposterior y mediolateral según lo que se describe en el presente Protocolo.
En este manuscrito, también hemos descrito cómo exponer quirúrgicamente y ablar de la CA. Hay tres pasos fundamentales: el proceso de perforación, la apertura y el retiro de las meninges y la ablación por aspiración. Perforación se debe realizar a una velocidad baja con la presión mínima, como una perforación de alta velocidad genera calor que puede afectar a cerca de las estructuras subcorticales. Sin embargo, mantener una velocidad baja y el área de perforación con solución salina estéril fría de refrigeración deben prevenir cualquier daño. Además, la presión mínima es esencial para evitar una rotura repentina del cráneo y lesiones posteriores a la corteza subyacente. La apertura y el retiro de las meninges que cubren el AC deben realizarse con cuidado para no romper los vasos sanguíneos. Si se presenta sangrado, es generalmente desfavorable el pronóstico temprano y tardío y es cuestionable si tal animal cumple los criterios de inclusión de un estudio confiable. Se recomienda la eutanasia en este caso. Por último, la aspiración (probablemente el aspecto más difícil en la realización de una efectiva lesión), debe limitarse a la materia gris. Hay dos indicadores que pueden ayudar a detectar la presencia de la sustancia blanca: (1) un cambio en el contraste de color, como la materia blanca es más brillante que la materia gris; y (2) el cese del sangrado de las arterias perforantes.
Después de cualquier manipulación realizada en el cerebro, es necesario evaluar la localización, tamaño y extensión del procedimiento en la corteza para el posterior análisis y validación de los datos obtenidos del animal. En este manuscrito, detallamos cómo localizar la ablación realizada en la corteza, utilizando un mapa de coordenadas descrito previamente por nuestro grupo18. Este mapa fue construido usando referencias anatómicas obtenidas de reconstrucciones de la sección serie de secciones histológicas, correlacionadas con el atlas de Paxinos y Watson de la rata cerebro22. En consecuencia, el mapa distingue entre la primaria (A1) y cortezas secundarias (Dorsal y Ventral) de la CA. La principal ventaja de este mapa de coordenadas es que permite la rápida localización de la lesión mediante la superposición de una fotografía tomada desde la superficie lateral del cerebro en una matriz de cerebro sagital. Otra ventaja es que los laboratorios con menos experiencia en anatomía pueden utilizar el mapa adaptándolo a sus modelos animales. Sólo es necesario establecer las distancias entre bregma y lambda referencias 0 interaural en un cerebro de control perfundido y escala el mapa arriba o hacia abajo en consecuencia. Usar el nebulizador nasal fisura como referencia para ajustar la imagen del cerebro para el mapa. La profundidad de la ablación no puede determinarse en este mapa de coordenadas, por lo que debe ser determinado en las secciones histológicas del cerebro.
La combinación de métodos estereotácticas con la exposición quirúrgica de la CA son métodos básicos que podrían adaptarse fácilmente por cualquier investigador que desee a la CA en la rata. Esto puede ser para un experimento agudo o uno que requiere la implantación de dispositivos permanentes. Además, la ablación quirúrgica de la AC se ha previamente utilizada como modelo para estudiar los efectos de privación crónica cortical en audiencia. Ablaciones AC podrían utilizarse también para estudiar los efectos que ablaciones AC unilaterales ejercen en otras áreas corticales, o servir como un modelo de movimiento. Así, los diseños experimentales que se describen aquí son métodos útiles que se pueden aplicar individualmente o en combinación con una amplia gama de diseños experimentales.
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación fue apoyada por una beca del Ministerio de economía y competitividad (MINECO) del gobierno de España, SAF2016-78898-C2-2-R.
Stereotaxic frame | David Kopf Ins. | 900 | |
Surgical microscope | WILD M650 Heerbrugg | ||
Heating pad | DAGA | ||
Dental micromotor | W&H elco | 5118 | |
Diamond burr | B Braun | GD021R | 0.6 mm |
Surgical suction device | Atmos | Atmoforte E2 | |
Ketamine | Merial | 30 mg/kg | |
Xylazine | Bayer | 5 mg/kg | |
Micromanipulator | Narishige | SM-11 | |
Scalpel | Lawton | ||
Povidone iodine | Meda | Betadine | |
sterile saline serum | B.Braun | ||
20G sterile needle | Terumo Neolus | ||
Cotton tips | |||
Suture material | B.Braun | ||
Antibiotic Ointment | Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) – Schering-Plough | ||
Forceps | dimeda | 10.331.12 | |
Surgical needles | World Precision Instruments | 501940 | |
Buprenorphine | Indivior UK | Buprex | 0.01-0.05 mg/kg |
Scissor | dimeda | 08.120.15 | |
Spencer scissor | dimeda | 08.804.14 | |
Rongeurs | Lawton | ||
Microsurgical knife | MSP | 7503 | |
Absorbable hemostatic gauze | Surgicel | ||
Saggital rat Brain Matrix | Activational systems Inc. | RBM-1000DV / RBM 4000C | |
Sodium pentobarbital | Vetoquinol | 0.1 mL | |
Camera | Olympus 5.1 MP | C-5060 wide zoom | lens F2.8-4.8 |
Wound clips | Reflex 9 | 9 mm | |
Canvas 12 | ACD Systems | ||
needle gauge | diameter 1.8 mm | ||
Separatory funnel | labbox | 11409 | 500 mL |
GluA2 primer Forward | GeneBank | NM_017261 | CGGCAGCTCAGCTAAAAACT |
GluA2 primer Reverse | GeneBank | NM_017261 | TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA |
GluA3 primer Forward | GeneBank | NM_032990 | ATTGCTGATGGTGCAATGAC |
GluA3 primer Reverse | GeneBank | NM_032990 | TTTGCATTGTCGCAAGTCTC |