Summary

Déterminer le taux de décroissance de Genome-wide transcription dans les fibroblastes humains proliférantes et repos

Published: January 02, 2018
doi:

Summary

Les auteurs décrivent un protocole pour générer la prolifération et quiescentes fibroblastes dermiques humains primaires, surveillance des taux de décomposition de transcription et d’identifier les gènes différentiellement en décomposition.

Abstract

Quiétude est un état temporaire, réversible dans lequel les cellules ont cessé la division cellulaire, mais conservent la capacité à proliférer. Plusieurs études, y compris la nôtre, ont démontré que la quiescence est associée aux changements répandus dans l’expression des gènes. Certains de ces changements se produisent à travers des changements dans le niveau ou l’activité des facteurs associés à la prolifération de transcription E2F et MYC. Nous avons démontré que carie ARNm peut également contribuer aux changements dans l’expression des gènes entre les cellules prolifèrent et repos. Dans ce protocole, nous décrivons la procédure pour établir les cultures de fibroblastes humains par voie cutanée prépuce proliférantes et repos. Nous décrivons ensuite les procédures permettant d’inhiber la nouvelle transcription dans des cellules proliférantes et repos avec l’actinomycine D (ActD). ActD traitement représente une approche simple et reproductible de dissociant nouvelle transcription de désintégration de la transcription. Un inconvénient du traitement ActD, c’est que le cours du temps doit être limité à un court laps de temps parce que ActD affecte la viabilité des cellules. Les niveaux de transcription sont surveillés au fil du temps afin de déterminer le taux de décroissance de transcription. Cette procédure permet l’identification des gènes et des isoformes qui présentent une carie différentielle chez prolifèrent par rapport aux fibroblastes quiescentes.

Introduction

Niveaux de l’état stationnaire de transcriptions reflètent la contribution de synthèse de transcription et de désintégration de la transcription. Réglementé et décomposition de transcription coordonnée est un mécanisme important pour contrôler les processus biologiques1,2,3,4. Par exemple, la vitesse de décomposition transcription ont démontré à contribuer à la série temporelle des événements après l’activation par le facteur de nécrose tumorale de cytokines inflammatoires5.

Nous avons déjà montré que la transition entre la prolifération et de la quiétude dans les fibroblastes humains primaires est associée aux changements dans les niveaux de transcription de nombreux gènes6. Certains de ces changements reflètent des différences dans l’activité de facteurs de transcription entre ces deux États.

Changements dans les taux de décroissance de transcription peuvent également contribuer à des changements dans le niveau d’expression d’un transcrit dans deux États différents7,8. D’après nos constatations antérieures que la transition entre la prolifération et la quiescence est associée aux changements dans les niveaux de multiples microARN9, nous avons demandé s’il y a également une contribution de désintégration de transcription différentielle dans les changements expression des gènes chez prolifèrent par rapport aux fibroblastes quiescentes.

Afin de contrôler la stabilité de la transcription, nous avons déterminé le taux de décomposition des transcriptions Génome-large en proliférant versus cellules quiescentes. Pour ce faire, nous avons mesuré la vitesse de décomposition en proliférant versus quiescentes fibroblastes en introduisant un inhibiteur de la nouvelle transcription et surveillance de la fréquence à laquelle des relevés de notes individuels ont disparu au fil du temps. L’avantage de cette approche est que, comparativement aux méthodes qui surveillent tout simplement l’expression des gènes globale, en inhibant la synthèse nouvelle transcription, nous serons en mesure de déterminer la vitesse de décroissance de ces transcriptions indépendamment de la vitesse à laquelle ils doivent transcription de l’acte.

ActD traitement d’inhiber la nouvelle transcription et déterminer le taux de décroissance de transcription a été appliqué avec succès dans plusieurs études antérieures. ActD a été utilisé pour disséquer l’importance de la stabilité du RNA dans les changements dans l’abondance de transcription qui résultent d’un traitement par des cytokines pro-inflammatoires,5. Une approche similaire a également servie à disséquer les différences dans les taux de décroissance de transcription en multiplient par rapport aux cellules C2C12 différenciées qu’ils adoptent un muscle différenciée phénotype10. Comme autre exemple, global mRNA demi-vies ont également été détectés dans pluripotentes et11des cellules souches embryonnaires de souris différenciées. Dans ces exemples, dégradation de l’ARNm s’est avérée être important pour réglementer l’abondance de la transcription et la transition de cellules à cellules différents États.

Appliquant les méthodes décrites ci-dessous, nous avons découvert changements dans les taux de décroissance de transcription dans environ 500 gènes lorsque l’on compare les fibroblastes prolifèrent et quiescentes États12. En particulier, nous avons découvert que les cibles des miARN miR-29, qui est diminuée dans les cellules quiescentes, sont stabilisés lorsque des cellules de transition de quiescence. Nous décrivons ici la méthodologie que nous permet de déterminer la vitesse de décomposition dans les cellules prolifèrent et repos. Cette méthode est utile pour comparer global taux de décomposition des ARNm dans deux distincts mais comparables si l’on cherche des informations sur la décomposition rapide des gènes. Il pourrait également être utilisé pour traiter d’autres questions telles que l’effet des conditions de culture cellulaire sur la décomposition de transcription, par exemple, en deux dimensions par rapport à trois dimensions cultures. La vitesse de décomposition peut être déterminée Génome-large avec des méthodes telles que les puces ou RNA-Seq. alternativement, en temps réel qPCR ou Northern blot peut être utilisé pour déterminer le taux de décomposition sur une base de gène par gène ou isoform-par-isoforme. Ces taux permet ensuite de calculer la demi-vie de chaque gène surveillé et d’identifier les gènes avec des taux de décomposition qui sont différents dans les deux conditions.

Protocol

Toutes les expériences décrites ont été approuvées par les comités de révision institutionnelle à l’Université de Princeton et l’Université de Californie, Los Angeles. 1. Préparez les fibroblastes prolifèrent et inhibées par Contact décours temporel ActD Remarque : Ce protocole utilise un timecourse avec quatre points. Trois échantillons biologiquement indépendants peuvent être collectées par validant en recueillant des plaques de culture de tis…

Representative Results

Nous avons déjà rapporté les résultats d’analyses de microarray de taux de décroissance de transcription dans les fibroblastes humains primaires proliférantes et inhibées par contact sur un cours de 8 heures12. Une liste de gènes avec un changement important dans la stabilité de transcription en comparant les fibroblastes proliférants et inhibées par contact est fournie dans le Tableau complémentaire 1. Les intensités de fluorescence…

Discussion

Quiescence peut être induite par des signaux externes, y compris le retrait des mitogènes ou le sérum, le manque d’adhésion cellulaire et l’inhibition de contact. Inhibition de contact, un des plusieurs méthodes possibles pour induire la quiescence, est un processus hautement évolutives conservé dans lequel les cellules sortie prolifératif cycle cellulaire en réponse à un contact cellule-cellule. Nous nous concentrons ici sur l’inhibition de contact à titre d’exemple d’une méthode pour induire la qu…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

HAC était le savant Milton E. Cassel de la Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Ce travail a été financé par des dons à la HAC from the National Institute of General Medical Sciences Centre bourse d’Excellence GM071508 P50 (P.I. David Botstein), PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879 à David août, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, Institut National des Sciences médicales générales R01 GM0866465, l’Eli & Edythe Broad Centre de médecine régénératrice & Stem Cell Research, NIH Health Center/UCLA ILEC féminin Iris Cantor Grant UL1TR000124 et la leucémie Lymphoma Society. Recherche rapporté dans cette publication a été financée par le National Cancer Institute de la National Institutes of Health, sous attribution numéro P50CA092131. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit. HAC est membre de l’Eli & Edythe large Centre de médecine régénératrice & Stem Cell Research, l’Institut de biologie moléculaire de UCLA et le programme interministériel de bioinformatique de UCLA.

Materials

Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C
Equipment for running agarose gels
Sterile tissue culture plates and conical tubes
Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-118
Fetal bovine serum VWR 35-010-CV
Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture
Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis
Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples
RNaseZap Invitrogen AM9780 For decontaminating work surfaces from RNase
2.0 ml eppendorf tubes
Trypsin-EDTA  Solution 10X Millipore Sigma 9002-07-07
Sterile PBS Life Technologies 14190-250
Trizol Thermo Fisher Scientific 15596018
Actinomycin D Millipore Sigma A1410-2 mg inhibits transcription
Sterile DMSO Fisher Scientific 31-761-00ML solvent for actinomycin D
Chloroform Thermo Fisher Scientific ICN19400225 MP Biomedicals, Inc product
Isopropanol Fisher Scientific BP2618500 molecular biology grade
Ethanol Fisher Scientific BP28184 molecular biology grade
RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) Thermo Fisher Scientific R0551 carrier for RNA precipitation
TURBO DNA-free Kit Thermo Fisher Scientific AM1907 removes DNA with DNase, then, in a subsequent step,  inactivates DNA and removes divalent cations
Agarose Thermo Fisher Scientific ICN820721 MP Biomedicals, Inc product
Loading dye for RNA gel Thermo Fisher Scientific R0641 suitable even for denaturing electrophoresis
Millenium RNA markers Thermo Fisher Scientific AM7150 RNA ladder
One-color RNA Spike-in Kit Agilent Technology 5188-5282 Example spike-in control for Agient microarray analysis
Tris base Fisher Scientific BP152-1 molecular biology grade, for TAE buffer
Glacial acetic acid Fisher Scientific A38-500 for TAE buffer
EDTA Fisher Scientific BP120-500 electrophoresis grade, for gels
Ethidium bromide Millipore Sigma E7637 for molecular biology
External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix Thermo Fisher Scientific 4456740 Spike-in control for RNA Seq
TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) Illumina RS-122-2101 for RNA Seq
96-well 0.3 ml PCR plate Thermo Fisher Scientific AB-0600 for real-time qPCR
Microseal B adhesive seals Bio-Rad MSB1001 for real-time qPCR
Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs VWR 89094-662 for real-time qPCR
Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps Thermo Fisher Scientific AM12230 for real-time qPCR
SuperScript Reverse Transcriptase Invitrogen 18090010 for real-time qPCR
AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880 for real-time qPCR

Referências

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Citar este artigo
Mitra, M., Lee, H. N., Coller, H. A. Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts. J. Vis. Exp. (131), e56423, doi:10.3791/56423 (2018).

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