Summary

Biblioteca de peptídeo sobreposição para mapear os resumos de Qa-1 em uma proteína

Published: December 20, 2017
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Summary

QA-1 (HLA-E em humanos) pertence a um grupo de moléculas de 1b complexo principal de histocompatibilidade não-clássica. Imunização com resumos de Qa-1-ligação foi mostrada para aumentar o tecido-específica Regulamento imune e amenizar várias doenças auto-imunes. Neste documento descrevemos uma estratégia de biblioteca de peptídeo sobreposição para a identificação de epitopos de Qa-1 em uma proteína.

Abstract

QA-1 (HLA-E em humanos) pertence a um grupo de não-clássica histocompatibilidade complexa 1b moléculas (MHC-Ib). Dados recentes sugerem que as moléculas de Qa-1 desempenham papéis importantes em Agrimensura células para integridade estrutural e funcional, induzindo o Regulamento imune e limitando a resposta imune a infecções virais. Além disso, funcional aumento de CD8 Qa-1-restrito+ T células através do epítopo imunização tem mostrado efeitos terapêuticos em vários modelos animais doença auto-imune, por exemplo, experimental encefalomielite alérgica, artrite induzida por colágeno e diabetes não-obesos. Portanto, há uma necessidade urgente de um método que pode eficientemente e rapidamente identificar epítopos de Qa-1 funcionais em uma proteína. Aqui, descrevemos um protocolo que utiliza o CD8 Qa-1-restrito+ célula T linhas específicas para uma biblioteca de peptídeo (OLP) sobrepostas para determinar os resumos de Qa-1 em uma proteína. Esta biblioteca OLP contém 15-mer sobreposição peptídeos que cobrem todo o comprimento de uma proteína, e peptídeos adjacentes se sobrepõem por 11 aminoácidos. Usando este protocolo, identificamos recentemente um epítopo de Qa-1 9-mer em glicoproteína oligodendrocyte de mielina (MOG). Este recém mapeada epítopo MOG Qa-1 foi mostrado para induzir CD8 epítopo específico, Qa-1-restrito+ T células desse regulamento imune reforçado de mielina específicos. Portanto, o presente protocolo é útil para futura investigação de novos objectivos e funções de CD8 Qa-1-restrito+ T células.

Introduction

QA-1 pertence a um grupo de não-clássica histocompatibilidade complexa 1b moléculas (MHC-Ib) em camundongos. Seu homólogo humano é HLA-E. Provas anteriores tem demonstrou que as moléculas de Qa-1 tem importantes funções biológicas. Em primeiro lugar, Qa-1 moléculas desempenham um papel importante no levantamento de células para a integridade estrutural e funcional. Neste aspecto, Qa-1 moléculas evoluíram diversas estratégias para monitorar a função normal de uma célula. Uma tal estratégia permite Qa-1 moléculas para formar complexos com um peptídeo líder transformados (epítopo), ou seja, o Qa-1 determinante modificador (Qdm) é processado a partir de moléculas de MHC-i clássicas no retículo endoplasmático1. Estes complexos de Qa-1/Qdm depois exibir na superfície de uma célula e ligam aos receptores inibitórios de NKG2A em células NK para inibir NK matar atividade2. Se a expressão de moléculas de MHC-i é perdida, uma célula (por exemplo, uma célula maligna) torna-se sensível para NK matar2. A outra estratégia permite Qa-1 moléculas formar novos complexos de Qa-1/epítopo na superfície de uma célula que é deficiente em TAP (transporte associado ao processamento de antígeno)3 e/ou ERAAP (retículo endoplasmático aminopeptidase associado processamento do antígeno)4 (ambas as deficiências muitas vezes ocorrem em células malignas). A célula que expressa estes novos complexos de Qa-1/epítopo pode ser reconhecida e eliminada pelo epítopo específico CD8 Qa-1-restrito+ T células. Em segundo lugar, moléculas de Qa-1 induzem Regulamento imune5. Neste aspecto, Qa-1/epítopo complexos têm sido mostrados para estimular CD8+ pilhas de T (Treg) reguladoras que são importantes para a prevenção do dano imune-mediada de autotecidos6,7,8 ,9,10. Em terceiro lugar, CD8 Qa-1-restrito+ Treg células têm sido mostradas para limitar as respostas imunes contra infecção viral11.

Portanto, aumento do específico do epítopo específico CD8 de Qa-1-restrictred+ T células é uma estratégia potencialmente promissora para a eliminação de células anormais, para o aprimoramento do Regulamento imune e para o controle da magnitude do induzida por vírus respostas imunes. Enquanto não tiver sido determinado se aumento de epítopo específico CD8 Qa-1-restrito+ T células podem reforçar a vigilância imunológica e limitar as respostas de imune induzida por vírus, nossos laboratórios e outros demonstraram claramente que imunização com resumos de Qa-1 pode aumentar a função de Qa-1-restrito CD8+ Treg células específicas para CD4 auto-imune patogénicos+ T células, levando ao controle eficiente de CD4+ doenças auto-imune mediada por células T em um variedade de animal modelos tais como encefalomielite alérgica experimental (um modelo animal do humano esclerose múltipla)6,10, artrite induzida por colágeno (um modelo animal de artrite de reumatoide humana)7, e diabetes não-obesos (um modelo animal de diabetes do tipo humano 1)8. Além disso, descobrimos que a imunização com um epítopo de Qa-1 tecido-específica leva a controle específico de inflamação imune-mediada em que o tecido através de aumento de CD8+ Treg células12. Os sucessos acima dos estudos pré-clínicos indicam a necessidade de uma avaliação completa de Qa-1 epítopo imunização para o tratamento de doenças de tecido-específica imune-mediada e potencialmente para o tratamento de outras doenças associadas com deficiências na TAP e ERAAP.

Nesse sentido, há uma demanda por uma tecnologia que pode confiantemente e rapidamente analisar resumos de Qa-1 em uma proteína. A este respeito, foi descrito um número limitado de epitopos de Qa-1 biologicamente importantes. A maioria destes resumos de Qa-1 foram identificada por acaso durante o estudo de CD8+ T célula respostas para bactérias13, células deficientes em torneira3, células deficientes em ERAAP4e células que causam EAE6, 9. Portanto, uma técnica de alta taxa de transferência é desejável para a identificação de epitopos de Qa-1 biologicamente importantes em uma proteína definido. A seguir, descrevemos uma estratégia de biblioteca de peptídeo (OLP) sobrepostas que mapeia funcionais epitopos de Qa-1 em uma proteína usando CD8 Qa-1-resrticted+ célula T linhas específicas para o pool OLP (OLP_pool) de uma proteína.

Protocol

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com um protocolo de uso aprovado pelo Comité de uso, a Universidade do Texas em El Paso e a Universidade de Loma Linda e cuidado Animal e institucional Cuidado Animal. 1. geração de uma biblioteca OLP abrange todo o comprimento de uma proteína Projete uma biblioteca da OLP na qual todos os peptídeos são mer-15 de comprimento, e peptídeos adjacentes se sobrepõem por 11 aminoácidos.Nota: No estudo MOG OLP, sequência…

Representative Results

Projeto de uma biblioteca OLP abrange todo o comprimento de uma proteína Começando no N-terminal de uma proteína, cada peptídeo é 15 aminoácidos (15-mer). Portanto, o primeiro peptídeo abrange a posição 1 para a posição 15. N-terminal do peptide segundo se sobrepõe com o C-terminal do peptide primeiro por 11 aminoácidos. Portanto, o segundo peptídeo abrange a posição 5, a posição 19. Desenha o resto dos peptides ?…

Discussion

Aqui, descrevemos um protocolo para a análise de resumos de Qa-1 em uma proteína. Em relação ao presente protocolo, várias outras estratégias também foram relatadas anteriormente. Em primeiro lugar, alogênico CD8+ linhas de células T e clones foram utilizados para a identificação do Qdm1. Em segundo lugar, um putativo Qa-1-motivo da análise de Qdm foi usado para a identificação da HSP60p216-224 e um epítopo TCRBV8.19,18…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Penelope Garcia para a assistência técnica e preparação deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado por uma pesquisa inovação Grant (RIG) do departamento de medicina da Universidade de Loma Linda (681205-2967) e uma concessão piloto da sociedade nacional de esclerose múltipla (PP1685) de XT.

Materials

The protein to be analyzed N/A N/A Sequence of the protein can be obtained from NCBI
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Cat#: D2650 SIGMA DMSO should be sterile and cell culture tested.
Kb-/-Db-/- mice The Lackson Laboratory Stock#: 019995 We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
AIM V Serum Free Medium ThermoFisher Scientific Cat#: 12055091
2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit ThermoFisher Scientific Cat#: 11333D
Bio-Gel P-100 Bio-Rad Cat#: 150-4171
Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
Trasfer pipette Globe Scientific Mfg#: 137238
Murine M-CSF PeproTech Cat#: 315-02
48-well tissue culture plates USA Scientific Cat#: CC7682-7548
Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom Sigma-Aldrich Cat#: Z372129 Sigma
1ml deep 06-well PP plate, sterile USA Scientific Item#: 1896-1110
Recombinant murine IL-2 PeproTech Cat#: 212-12
Recombinant murine IL-7 PeproTech Cat#L: 217-17
Capture anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
ELISPOT plate Sigma-Aldrich Cat#: S2EM004M99
C1R ATCC Cat#: ATCC CRL-1993
C1R.Qa-1b Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
Qa-1 lentiviral vector GeneCopoeia Product#: Mm02955
Detection anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
Tween20 Sigma-Aldrich Cat#: P9416
Streptavidin-HRP BD Biosciences Cat#: BD557630
AEC substrate BD Biosciences Cat#: 551951
ImmunoSpot Analyzer ImmunoSpot Any immunoSpot analyer should work for this purpose.

Referências

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Xu, Y., Wasnik, S., Baylink, D. J., Berumen, E. C., Tang, X. Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein. J. Vis. Exp. (130), e56401, doi:10.3791/56401 (2017).

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