JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

التلاعب جزيء واحد من كوادروبليكسيس ز بملاقط مغناطيسية

Published: September 19, 2017
doi:
10.3791/56328
, , , ,
1School of Pharmacy, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, 2Mechanobiology Institute,National University of Singapore, 3Department of Physics,National University of Singapore, 4Research Institute for Biomimetics and Soft Matter, Fujian Provincial Key Lab for Soft Functional Materials Research, Department of Physics,Xiamen University, 5Center for Bioimaging Sciences,National University of Singapore

Summary

منصة ملاقط مغناطيسية جزيء واحد للتعامل مع كوادروبليكسيس ز هو عنها، مما يسمح لدراسة الاستقرار G4 وتنظيم البروتينات المختلفة.

Abstract

بنية الحمض النووي المتعارف عليه عدم الثانوية ز-قوادروبليكسيس (G4) تشارك في العمليات الخلوية المتنوعة، مثل تكرار الحمض النووي، والنسخ، وتجهيز الجيش الملكي النيبالي، واستطالة telomere. خلال هذه العمليات، وربط مختلف البروتينات وحل هياكل G4 أداء وظيفتها. وظيفة G4 غالباً ما يعتمد على استقرار هيكلها مطوية، من المهم أن التحقيق في كيفية تنظيم G4 ملزم البروتينات استقرار G4. ويعرض هذا العمل وسيلة التعامل مع جزيئات G4 واحد استخدام الملقط المغناطيسي، الذي يتيح للدراسات المتعلقة بتنظيم G4 ملزم البروتينات في جزيء G4 واحد في الوقت الحقيقي. بشكل عام، هذا الأسلوب مناسبة لنطاق واسع من التطبيقات في الدراسات لتفاعلات البروتينات/يغاندس والأنظمة المتعلقة بمختلف الهياكل الثانوية الحمض النووي الريبي أو.

Introduction

الذين تقطعت بهم السبل-أربعة هياكل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي G4 أدواراً حاسمة في العديد من العمليات البيولوجية المهمة1. تشارك العديد من البروتينات في ملزمة G4 والتنظيم، بما في ذلك telomere ملزم البروتينات (تيلوميراسي، POT1، تيببس TRF2، الجيش الوطني الرواندي)1،2، عوامل النسخ (نوكليولين، PARP1)3من الحمض النووي الريبي معالجة البروتينات (hnRNP A1، hnRNP A2)4,5من هيليكاسيس (بلم، فانكج، وراو، تحذير، Dna2، Pif1)، وتكرار الحمض النووي المتعلقة بالبروتينات (بريمبوليميراسي Rif1، REV1،)6. يمكن تثبيت ملزمة البروتين أو زعزعة استقرار هياكل G4؛ وهكذا تنظم الوظائف البيولوجية اللاحقة. وكان يقاس استقرار G4 الحراري ذوبان باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) أو طرق دائرية تلوانيه (CD)7. غير أن هذه الشروط لا الفسيولوجية ذات الصلة، ومن الصعب أن تطبق على دراسة آثار ملزمة بروتينات7.

وقد مكن التطور السريع في تقنيات التلاعب جزيء واحد الدراسات قابلة للطي والتي تتكشف من بيوموليكولي، مثل الحمض النووي أو بروتين، على مستوى جزيء واحد مع القرار نانومتر في الوقت الحقيقي8. مجهر القوة الذرية (AFM)، وملاقط بصرية، وملاقط مغناطيسية هي أساليب التلاعب جزيء واحد الأكثر استخداماً. بالمقارنة مع فؤاد وملاقط بصرية9، تسمح ملاقط مغناطيسية قياسات مستقرة للديناميات التي تتكشف للطي لجزيء واحد على مر الأيام باستخدام10،تقنية لمكافحة انجراف11.

هنا، هو منبر تلاعب جزيء واحد استخدام الملقط المغناطيسي لدراسة تنظيم الاستقرار G4 ملزمة بروتينات عنها12،13. ويوجز هذا العمل النهج الأساسية، بما في ذلك عينة وتدفق إعداد القناة وإعداد ملاقط مغناطيسية، ومعايرة القوة. تسمح سيطرة القوة وبروتوكولات مكافحة الانجراف كما هو موضح في الخطوة 3 لمقاييس الزمن منذ فترة طويلة تحت مختلف عناصر القوة، مثل قوة ثابتة (قوة المشبك) وتحميل ثابت معدل (القوة-منحدر)، وقياس قوة القفز. يتيح البروتوكول معايرة القوة هو موضح في الخطوة 4 معايرة القوة < 1 ميكرومتر الحبال القصيرة على مدى قوة واسعة النطاق pN يصل إلى 100، مع خطأ نسبي في حدود 10%. مثال على التنظيم لاستقرار هيليكاز الحمض النووي الريبي المرتبطة بالاتحاد الأفريقي-الغنية بعنصر (راو) هيليكاز (الملقب DHX36، G4R1) التي تضطلع بأدوار أساسية في حل يستخدم G4 الحمض النووي الريبي لإظهار تطبيقات هذا البرنامج13.

Protocol

1-“إعداد G4 الحمض النووي” لتمتد جزيء واحد تحضير 5 '-ثيول المسمى و 5 '-البيوتين المسمى دسدنا مقابض باستخدام دنا بوليميريز في قالب الحمض النووي بالعاثية أمداً باستخدام 5 PCR '-ثيول و 5 '-البيوتين كبسولة تفجير 14 ( الشكل 1). كلا المقابض دسدنا يكون المحتوى العا?…

Representative Results

إعداد تجربة تمتد جزيء G4 واحد يرد في الشكل 4. وكان المربوطة تسلسل تشكيل واحد-الذين تقطعت بهم السبل G4 موزعة بين اثنين من مقابض دسدنا بين ساترة وحبه باراماجنيتيك. للبحث عن حبة واحدة دسدنا المربوطة، أنجز مقايسة افرسترتش بزيادة القوة في معدلات التحميل المستمر. …

Discussion

كما هو موضح أعلاه، منبرا لدراسة استقرار الحمض النووي G4 الميكانيكية وتفاعلات البروتين باستخدام G4 يقال ملاقط مغناطيسية جزيء واحد. المصاحبة للمنهاج، هي وضع بروتوكولات ذات كفاءة عالية للعثور على حبل G4 الحمض النووي، وقياس الديناميات التي تتكشف للطي واستقرار الهيكل G4 مع القرار الخاص نانومتر. …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون عموم منغ لتصحيح التجارب المطبعية المخطوط. ويدعم هذا العمل “سنغافورة وزارة للتعليم الأكاديمي البحث صندوق الطبقة” 3 (MOE2012-T3-1-001) إلى ج. ي؛ المؤسسة الوطنية للبحوث عن طريق معهد ميتشانوبيولوجي سنغافورة إلى ج. ي؛ المؤسسة الوطنية للبحوث، مكتب رئيس الوزراء، سنغافورة، ضمن “برنامجها إينفيستيجاتورشيب جبهة الخلاص الوطني” (جبهة الخلاص الوطني رقم إينفيستيجاتورشيب جائزة جبهة الخلاص الوطني-NRFI2016-03 إلى ج. ي؛ صندوق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (2017KFYXJJ153) إلى ص حاء.

Materials

DNA PCR primers IDT DNA preparations
DNA PCR chemicals NEB DNA preparations
restriction enzyme BstXI NEB R0113S DNA preparations
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) BMH.BIOMEDIA 72204 flow channel preparation
Decon90 Decon Laboratories Limited flow channel preparation
APTES Sigma 440140-500ML flow channel preparation
Sulfo-SMCC ThermoFisher Scientific 22322 flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidin ThermoFisher Scientific 11205D flow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm Polysciences, Inc 17145-5 flow channel preparation
2-Mercaptoethanol Sigma M6250-250ML flow channel preparation
Olympus Microscopes IX71 Olympus IX71 Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721 Physik Instrumente P-721 Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X Olympus MPLAPON-Oil 100X Magnetic tweezers setup
CCD/CMOS camera AVT Pike F-032B Magnetic tweezers setup
Translation linear stage Physik Instrumente MoCo DC Magnetic tweezers setup
LED Thorlabs MCWHL Magnetic tweezers setup
Cubic Magnets Supermagnete Magnetic tweezers setup
Labview National Instruments Magnetic tweezers setup
OriginPro/Matlab OriginLab/MathWorks Data analysis
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
  2. Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
  3. Gonzalez, V., Hurley, L. H. The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity. Bioquímica. 49 (45), 9706-9714 (2010).
  4. Wang, F., et al. telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).
  5. Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
  6. Schiavone, D., et al. PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells. Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).
  7. Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. Stability and kinetics of G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).
  8. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).
  9. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  10. Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).
  11. Chen, H., et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces. J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).
  12. You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation. J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).
  13. You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis. Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).
  14. You, H., et al. Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension. Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).
  15. Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. Two distinct overstretched DNA states. Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).
  16. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).
  17. Fu, H., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
  18. Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
  19. Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
  20. Chen, H., et al. Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA. Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).
  21. Fu, H. X., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
  22. Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
  23. Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
  24. Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
  25. Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
  26. De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).
  27. Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).
  28. Le, S., et al. Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies. Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).
  29. Neidle, S. Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets. J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).
  30. Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome. FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).
  31. Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy?. Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).
  32. Amato, J., et al. Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives. J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).
  33. Wells, R. D. Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease. Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).

Tags

G-quadruplexMagnetic TweezersSingle-molecule ManipulationFolding And UnfoldingBinding ProteinsDNA-protein InteractionsHelicase ActivityDNA Tether FormationParamagnetic BeadsNanometer-scale Dynamics

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (127), e56328, doi:10.3791/56328 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image