Singel-molekyl Manipulation av G-quadruplexes av magnetisk pincett
Summary
En enda-molekyl magnetisk pincett plattform att manipulera G-quadruplexes rapporteras, vilket möjliggör studier av G4 stabilitet och reglering av olika proteiner.
Abstract
Icke-kanoniska nukleinsyra sekundärt strukturera G-quadruplexes (G4) är involverade i olika cellulära processer, såsom DNA-replikation, transkription, RNA bearbetning och telomer förlängning. Under dessa processer, olika proteiner binder och löser G4 strukturer för att utföra sin funktion. Eftersom funktionen av G4 beror ofta på stabiliteten i dess vikta struktur, är det viktigt att undersöka hur G4 bindande proteiner reglerar stabiliteten i G4. Detta arbete presenterar en metod för att manipulera enda G4 molekyler använder magnetisk pincett, vilket möjliggör studier av regleringen av G4-bindande proteiner på en enda G4 molekyl i realtid. I allmänhet, är denna metod lämplig för ett brett tillämpningsområde applikationer i studier för proteiner/ligander interaktioner och bestämmelser om olika DNA eller RNA sekundära strukturer.
Introduction
Fyra-strängat DNA eller RNA G4 strukturer spelar viktiga roller i många viktiga biologiska processer1. Många proteiner är involverade i G4 bindande och förordning, inklusive telomer-bindande proteiner (telomeras, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, transkriptionsfaktorer (nucleolin, PARP1)3, RNA processing proteiner (hnRNP A1, hnRNP A2)4, Helikas (BLM, FANCJ, RHAU, VARN, Dna2, Pif1)5och DNA-replikation relaterade proteiner (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Proteinbindning kan stabilisera eller destabilisera G4 strukturer. således reglerar de efterföljande biologiska funktionerna. Stabiliteten i G4 mättes genom termisk smältande använder ultraviolett (UV) eller cirkulärdichroism (CD) metoder7. Sådana villkor är dock inte fysiologiskt relevanta och är svåra att tillämpa att studera effekter av bindande proteiner7.
Den snabba utvecklingen i singel-molekyl manipulation teknik har möjliggjort studier av vikning och unfoldingen av en biomolecule, såsom en DNA eller ett protein, på en singel-molekyl nivå med nanometer upplösning i realtid8. Atomic force microscopy (AFM), optisk pincett och magnetisk pincett är de vanligaste metoderna som singel-molekyl manipulation. Jämfört med AFM och optisk pincett9, tillåter magnetisk pincett stabil mätningar av vikning-utspelas dynamiken i en enda molekyl över dagar med hjälp av en anti drift teknik10,11.
Här är en singel-molekyl manipulation plattform använder magnetisk pincett för att studera regleringen av G4 stabilitet genom bindande proteiner rapporterade12,13. Detta arbete beskriver de grundläggande metoder, inklusive prov och flöde kanal förberedelse, inställningen av magnetisk pincett och kraft kalibreringen. Kontrollen kraft och anti drift protokoll som beskrivs i steg 3 kan för lång tid mätningar enligt olika kraft kontroller, till exempel konstant kraft (kraft clamp) och konstant lastning Betygsätt (kraft-ramp) och kraft-hoppa mätning. Kraft kalibrering protokollet beskrivs i steg 4 gör kraft kalibrering av < 1 µm kort tjuder över en bred kraft sträcker sig upp till 100 pN, med ett relativt fel inom 10%. Ett exempel på reglering av stabiliteten i de RNA Helicase associerade med AU-rika element (RHAU) helicase (alias DHX36, G4R1) som spelar viktiga roller att lösa RNA G4 används för att demonstrera tillämpningar av denna plattform13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som beskrivits ovan, en plattform för att studera den mekaniska stabiliteten av G4 DNA och samspelet mellan protein till G4 med är singel-molekyl magnetisk pincett rapporterade. Medföljande plattformen, utvecklas högeffektiva protokoll att hitta G4 DNA tjuder, och mätning av vikning-utspelas dynamik och stabilitet G4 struktur med nanometer särskild resolution. Fokalplan låsa möjliggör mycket stabila anti drift kontroll, vilket är viktigt för att upptäcka en liten struktur övergång till exempel G4 (steg stor…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Meng Pan för korrekturläsning manuskriptet. Detta arbete stöds av Singapore ministeriet för Utbildning akademisk forskning fonden Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) till J.Y.; den National Research Foundation genom den Mekanobiologi Institute Singapore till J.Y.; National Research Foundation, premiärministerns kontor, Singapore, under dess NRF Investigatorship programmet (NRF Investigatorship Award No. NRF-NRFI2016-03 – J.Y.; den grundläggande forskningsfonden för Central universiteten (2017KFYXJJ153) till H. Y.
Materials
| DNA PCR primers | IDT | DNA preparations | |
| DNA PCR chemicals | NEB | DNA preparations | |
| restriction enzyme BstXI | NEB | R0113S | DNA preparations |
| coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) | BMH.BIOMEDIA | 72204 | flow channel preparation |
| Decon90 | Decon Laboratories Limited | flow channel preparation | |
| APTES | Sigma | 440140-500ML | flow channel preparation |
| Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | flow channel preparation |
| M-280, paramganetic beads,streptavidin | ThermoFisher Scientific | 11205D | flow channel preparation |
| Polybead Amino Microspheres 3.00 μm | Polysciences, Inc | 17145-5 | flow channel preparation |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250-250ML | flow channel preparation |
| Olympus Microscopes IX71 | Olympus | IX71 | Magnetic tweezers setup |
| Piezo-Z Stages P-721 | Physik Instrumente | P-721 | Magnetic tweezers setup |
| Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | Magnetic tweezers setup |
| CCD/CMOS camera | AVT | Pike F-032B | Magnetic tweezers setup |
| Translation linear stage | Physik Instrumente | MoCo DC | Magnetic tweezers setup |
| LED | Thorlabs | MCWHL | Magnetic tweezers setup |
| Cubic Magnets | Supermagnete | Magnetic tweezers setup | |
| Labview | National Instruments | Magnetic tweezers setup | |
| OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | Data analysis |
Referências
- Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
- Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
- Gonzalez, V., Hurley, L. H. The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity. Bioquímica. 49 (45), 9706-9714 (2010).
- Wang, F., et al. telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).
- Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
- Schiavone, D., et al. PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells. Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).
- Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. Stability and kinetics of G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).
- Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Chen, H., et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces. J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).
- You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation. J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).
- You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis. Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).
- You, H., et al. Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension. Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).
- Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. Two distinct overstretched DNA states. Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).
- Fu, H., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Chen, H., et al. Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA. Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Fu, H. X., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
- Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
- De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).
- Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).
- Le, S., et al. Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies. Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).
- Neidle, S. Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets. J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).
- Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome. FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).
- Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy?. Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).
- Amato, J., et al. Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives. J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).
- Wells, R. D. Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease. Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).
