JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genética

CRISPR/Cas9 Protein gen düzenleme için mikroenjeksiyon kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, embriyo içine

Published: January 20, 2018
doi:
10.3791/56275
, , , , , , ,
1School of Fisheries, Aquaculture and Aquatic Sciences,Auburn University, 2Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine,Suez Canal University, 3Anatomy and Embryology Department, Faculty of Veterinary Medicine,Cairo University, 4Department of Molecular Physiology and Biophysics,Vanderbilt University, 5Life Science Institute,University of Michigan

Summary

Gen kanal yayın balığı embriyo CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak düzenleme için basit ve etkili mikroenjeksiyon protokol sunulmuştur. Bu protokol için RNA’ların rehberlik ve Cas9 protein tek hücreli embriyo sarısı microinjected. Bu protokol iki kanal yayın balığı bağışıklık ile ilgili genlerin knocking tarafından doğrulandı.

Abstract

Kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, Komple genom, kanal yayın balığı gen işlev eğitim için daha büyük fırsatlar için önde gelen Sıralı. Gene nakavt bu gen fonksiyonları içinde vivoçalışmada kullanılmaya başlanmıştır. Kümelenmiş düzenli olarak kısa palindromik tekrarlar/ilişkili CRISPR protein 9 (CRISPR/Cas9) interspaced güçlü bir araç genomik DNA dizileri gene işlevi değiştirmek için düzenlemek için kullanılan bir sistemdir. Geleneksel bir yaklaşım içine tek hücreli embriyo mikroenjeksiyon ile CRISPR/Cas9 mRNA tanıtmak olmuştur iken, bu yayın balığı yavaş ve verimsiz bir işlemde olabilir. Burada, mikroenjeksiyon kanal yayın balığı embriyo CRISPR/Cas9 protein ile detaylı bir protokol açıklanmıştır. Kısaca, yumurta ve sperm toplanan ve daha sonra suni döllenme gerçekleştirilen vardı. Döllenmiş yumurta Holtfreter’ın solüsyon içeren bir petri için transfer edildi. Enjeksiyon hacmi kalibre edilmiş ve daha sonra geçiş ücreti/İnterlökin 1 reseptör etki alanını içeren bağdaştırıcı molekül (TICAM 1) gen ve rhamnose bağlayıcı lektin (RBL) gen tek hücreli embriyo sarısı microinjected RNA’ların / Cas9 hedefleme rehberlik. Gen nakavt başarılı olduğu indels DNA sıralama tarafından teyit edildi. Tahmin edilen protein sıra değişiklikler nedeniyle bu mutasyonlar frameshift dahil ve protein erken kodon nedeniyle kesildi.

Introduction

Mikroenjeksiyon, DNA, RNA, protein ve oluştururlar gibi bir madde küçük bir miktar hücreler veya embriyo ile cam kapiller1teslim etmek için kullanılan ortak bir laboratuvar tekniktir. Mikroenjeksiyon bir microinjector, micromanipulator ve mikroskop2de dahil olmak üzere özel ekipman Kurulumu kullanılarak gerçekleştirilir. Teknik genetik transgenics, gen Renkleri çakıştırmama ve gen terapisi, nesil hücre içi bileşenleri3,4 dinamiklerini anlamak amacıyla aracılığıyla birçok organizmalar değiştirmek için araştırmacılar tarafından kullanılan , 5.

Kanal yayın balığı (Ictalurus punctatus) su ürünleri en popüler yayın balığı türler ve eğlence balıkçılık faaliyetleri Amerika Birleşik Devletleri olduğunu. İşlevsel genomik kanal yayın balığı eğitim için artan bir ihtiyaç ve kanal yayın balığı tam genomunun sıralama genom düzenleme araçları6,7son gelişmeler yarar artırır. Gen işlevini anlama sadece yayın balığı üzerinde yürütülen araştırma zenginleştirmek istiyorsunuz değil, ama aynı zamanda daha etkili genetik geliştirme programları için yayın balığı sanayi geliştirmek için neden olabilir. İlgi belirli bir özellik için kritik gen tanımlandıktan sonra onlar genetik olarak yararlı allelleri oluşturmak için genom düzenlemeyi kullanarak yayın balığı üretimi seçimi için zararlı gen aktarımı, bastırmak bu gen artırmak için kullanılabilir transgenesis veya bu seçeneklerin bir bileşimini yararlı gen. Bir balık farklı türlerden farklı ticari olarak yararlı özellikleri için en iyi genler birleştirerek büyük ölçüde verimlilik ve karlılık balık üretim işlemleri8artıracak.

Gene nakavt gen fonksiyonları içinde vivoçalışmaya doğrudan bir yöntemdir. Mutasyonlar DNA düzeyinde etkileri çalışmanın farklı generations kolaylaştıracaktır gelecek nesiller tarafından devralınır. Farklı genom düzenleme araçları gelişmiş dahil olmak üzere çinko parmak enzimler (ZFNs), transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör enzimler (TALENs) edilmiş ve düzenli olarak interspaced kısa palindromik tekrarlar/CRISPR-ilişkili protein 9 (CRISPR/Cas9 kümelenmiş ) sistem9,10,11,12.

CRISPR/Cas9 sistem genomik DNA dizileri gene nakavt balık RNA güdümlü siteye özgü DNA bölünme5,13arası da dahil olmak üzere düzenlemek için kullanılan güçlü ve etkili bir araçtır. Genom ve bir DNA endonükleaz enzimi, Cas9 hedeflenen sırayla belirleyen bir Kılavuzu RNA (gRNA), sistem oluşur. CRISPR/Cas9 sistem genom herhangi bir sırayla ZFNs ve TALENs çeşitli avantajlar ile hedef için tasarlanmış olması: (1) daha düşük (2) kolay (3) daha özel bağlayıcı Guide RNA hedef sıra için mühendislik maliyet ve hedef kapalı mutasyonlar (4) azaltılmış birden çok dizileri aynı time (5) yüksek mutagenesis oranda TALENs ve (6) geliştirilmiş germline iletim hızıyla mutasyonlar için ilâ 6-fold ZFNs TALENs ve14içinkarşılaştırıldığında mutasyona uğramış değil genlerdeki farklı gRNA ile hedef alınabilmesi, 15,16,17,18.

Ana alternatif mikroenjeksiyon için çoğalmasıyla, elektrik darbeleri embriyo veya hücre membran geçirgenliği ve biyolojik moleküllerin19,20alımını artırmak için uygulanan bir yöntemdir. Birkaç transgenik balık çoğalmasıyla medaka (Oryzias latipes), Zebra balığı (Danio rerio), chinook somon (Oncorhynchus tshawytscha), kanal yayın balığı, çipura (Sparus sarba) gibi kullanarak oluşturulan ve ortak sazan (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.

Elektroporasyon plazmid DNA, RNA ve Cas9 protein gen nakavt için teslim etmek için kullanılmıştır. Memeli hücrelerinde, Cas9/gRNA plazmid DNA, Cas9 mRNA/gRNA ve Cas9 protein/gRNA kompleksleri elektroporasyon kullanarak teslim edildi ve mutagenesis gore Cas9 protein/gRNA kompleksleri çoğu elektroporasyon test koşulları27için kullanarak en yüksek. Ascidian Kordalılar (Ciona intestinalis), electroporated birden çok gen28nakavt ikna etmek için döllenmiş yumurta içine TALENs yapıları ifade edildi. Plazmid yapıları ifade ZFNs electroporated Lüteinizan kanal yayın balığı29nakavt olduğunu. Ancak, bir kez hücre içine tanıttı, plazmid yapıları için RNA transkripsiyonu ve büyük olasılıkla için RNA’ın mikroenjeksiyon göre mutagenesis zaman erteleyecek istenen DNA dizisi hedefleyebilirsiniz önce işlevsel proteinler için tercüme gerekir / protein. Bir embriyo geliştiriyor, gecikmeli mutagenesis enjekte kurucuları mozaizm artar. Buna ek olarak, transgenik ifade mutagenesis verimliliği düşürücü mikroenjeksiyon ile mümkün ifade seviyesine ulaşmak mümkün değildir.

Hücrelere genom düzenleme araçları tanıtmak için bir araç olarak mikroenjeksiyon çoğalmasıyla birçok avantajı vardır. Molekülleri düzenleme genom güvenilir bir şekilde hücreleri veya mikroenjeksiyon30ile embriyo içine tanıttı olabilir. Daha az enjeksiyon malzeme gereklidir. Enjekte malzeme miktarlarını belirlemek kolaydır. Daha yüksek mutasyon oranları düşük mozaizm kurucusu balık ile olabilir hangi-cekti geliştirmek germline iletim F1mutasyonların elde. Daha az kurucusu balık daha yüksek mutasyon oranı nedeniyle ilk nesil üretmek için çözümlenmesi gerekir. Elektroporasyon içinde daha fazla kurucusu balık analiz edilecek olan maliyeti artacak gerekir. Ancak, bu daha fazla embriyo31,32enjekte edilerek üstesinden gelebilir rağmen kanal yayın balığı microinjected embriyo yaşama electroporated olanlar, düşüktür. Kanal yayın balığı, yumurta sarısı microinjected embriyo 16’dan bağlı olarak hedef genlerin % 55 arasında değişiyordu yaşama ve gRNA/Cas9 protein32doz.

Yayın balığı embriyo düzenli mikroenjeksiyon teknik olarak talep ediyor ve zaman alıcı ancak, hızlı ve verimli CRISPR/Cas9 protein mikroenjeksiyon protokolü için kanal yayın balığı embriyo sunulur. CRISPR/Cas9 protein çözüm bir hücre embriyo sarısı enjekte edilir beri bu iletişim kuralı daha az zaman ve uzmanlık gerektirir. Döllenmiş yumurta yüzlerce 1 h (yaklaşık zaman gerçekleşmesi ilk hücre bölünmesi gerekli) enjekte edilir. Protokol doğrulamak için iki hastalığı duyarlılık ile ilgili gen kanal yayın balığı, geçiş ücreti/İnterlökin 1 reseptör etki alanını içeren bağdaştırıcı molekül (TICAM1) gen ve rhamnose bağlayıcı lektin (RBL) gen nakavt. TICAM 1 toll benzeri reseptör (TLR) 3 tarafından başlatılan sinyal yolu ilgilenmektedir. Kanal catfish TICAM 1 önemli ölçüde downregulated mavi kedi balığı, bir tür dirençli E. ictaluri33içinde iken bakteriyel meydan okuma ile Edwardsiella ictaluri, takip upregulated oldu. RBL oynar önemli bir rol ile Flavobacterium columnare, columnaris hastalığı, hastalığının erken enfeksiyon akut nerede ve sağlam upregulation göre columnaris duyarlı kanal yayın balığı gerginlik kaydedildi bir columnaris dirençli34.

Protocol

Bu yapılan balık genetik araştırma birimi, E. W. kabuk balıkçılık Araştırma Merkezi, Auburn Üniversitesi, AL. Deneme başlatılmadan önceki bu deneyde kullanılan tüm deneysel protokoller Auburn Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (AU-IACUC) tarafından kabul edildi. Bir liste bu deneyde kullanılan malzemeleri ve Ekipmanları Malzemeleri tablosunda bulunabilir. Aşağıdaki adımlar ve yordamlar için hazırlık ve mikroenjeksiyon kanal yayın balığı tek hücreli embriyo <strong cl…

Representative Results

Mikroenjeksiyon protokolünün etkinliği göstermek için kanal yayın balığı otoyol/İnterlökin 1 reseptör etki alanını içeren bağdaştırıcı molekül (TICAM1) gen ve rhamnose bağlayıcı lektin (RBL) gen hedeflemek için tasarlanmış gRNAs microinjected. TICAM 1DNA sıralama vektörlerin havuza alınan, klonlanmış PCR ürünleri bireysel kolonilerden TICAM 1 gen indüklenen Indel mutasyonla…

Discussion

Mikroenjeksiyon gen nakavt elde etmek için kanal yayın balığı embriyolar için detaylı bir protokol sunuldu. Enjeksiyon CRISPR/Cas9 proteinin sarısı çok daha kolaydır zaman kazandırır ve does değil istemek en gen transferi ve gen balıkla düzenleme için ortak teknik tek hücreli embriyo blastodisc microinjecting için karşılaştırıldığında kapsamlı eğitim 30 , 42. Geçerli protokol kanal yayın balığı TICAM 1 ile RBL gen indels inducing…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma için Roger Cone USDA-NIFA Ödülü 2015-67015-23488 tarafından finanse edildi. Yazarlar Dr. Ronald Phelps damızlık stok seçim ölçütü video açıklaması için teşekkür ederiz. Ahmed Elaswad ve Karim Khalil Mısır kültür ve eğitim büro Washington DC’de doktora araştırma finansmanı için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Reproboost implant Center of Marine Biotechnology Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females
TRICAINE-S Western Chemical. Inc. For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. 
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 0.5%, sterile filtered
Stereo microscope Olympus 213709 For visualizing the eggs during microinjection
Microinjector ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MPPI-3 For the delivery of the injection material into the embryos
Micromanipulator ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MM33  For holding and controlling the movement of the injection needle. 
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956.003 For loading injection solution into microinjection needles.
Vertical needle puller David Kopf Instruments Model 720 For pulling microinjection needles
Cas9 protein PNA Bio Inc.  CP01 Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR System  Roche Diagnostics, USA For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation
Borosilicate glass capillaries Fisher Scientific 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.
Petri dish VWR 25384-302 For holding the embryos during the microinjection.
Crisco The J.M. Smucker Company Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. 
Holtfreter`s solution Home Made 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. 
Doxycycline hyclate USP (monohydrate) Letco Medical 690904 Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
  2. Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. . Components of a microinjection system. , 935-939 (2011).
  3. Du, S. J., et al. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an "all fish" chimeric growth hormone gene construct. Nat. Biotechnol. 10 (2), 176-181 (1992).
  4. Davis, B., Brown, D., Prokopishyn, N., Yannariello-Brown, J. Micro-injection-mediated hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (4), 412-419 (2000).
  5. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  6. Liu, Z., et al. The channel catfish genome sequence provides insights into the evolution of scale formation in teleosts. Nat. Commun. 7, (2016).
  7. Abdelrahman, H., et al. Aquaculture genomics, genetics and breeding in the United States: current status, challenges, and priorities for future research. BMC Genomics. 18 (1), 191 (2017).
  8. Dunham, R. A. . Aquaculture and Fisheries Biotechnology : Genetic Approaches. , (2011).
  9. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  10. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  11. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 41 (20), 9584-9592 (2013).
  16. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  17. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  18. Li, M., Zhao, L., Page-McCaw, P. S., Chen, W. Zebrafish genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Trends Genet. 32 (12), 815-827 (2016).
  19. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841 (1982).
  20. Powers, D. A., et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 301-308 (1991).
  21. Inoue, K., et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differ. Dev. 29 (2), 123-128 (1990).
  22. Buono, R., Linser, P. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 271-275 (1991).
  23. Sin, F., et al. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture. 117 (1-2), 57-69 (1993).
  24. Dunham, R. A., et al. Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus possessing cecropin genes. Mar. Biotechnol. 4 (3), 338-344 (2002).
  25. Lu, J. K., Fu, B. H., Wu, J. L., Chen, T. T. Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods. Mar. Biotechnol. 4 (3), 328-337 (2002).
  26. Cheng, Q., et al. Interaction of diet and the masou salmon Δ5-desaturase transgene on Δ6-desaturase and stearoyl-CoA desaturase gene expression and N-3 fatty acid level in common carp (Cyprinus carpio). Transgenic Res. 23 (5), 729-742 (2014).
  27. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 208, 44-53 (2015).
  28. Treen, N., et al. Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts by TALEN electroporation provide new approaches to investigating gene function in Ciona. Development. 141 (2), 481-487 (2014).
  29. Qin, Z., et al. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Mar. Biotechnol. 18 (2), 255-263 (2016).
  30. Qin, Z. . Gene editing of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and gonadotropin-releasing hormone genes to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 technologies. , (2015).
  31. Dunham, R. A., Winn, R. N., Pinkert, C. A. . Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. , 308-336 (2014).
  32. Elaswad, A. . Genetic technologies for disease resistance research and enhancement in catfish. , (2016).
  33. Baoprasertkul, P., Peatman, E., Somridhivej, B., Liu, Z. Toll-like receptor 3 and TICAM genes in catfish: species-specific expression profiles following infection with Edwardsiella ictaluri. Immunogenetics. 58 (10), 817-830 (2006).
  34. Thongda, W., Li, C., Luo, Y., Beck, B. H., Peatman, E. L-rhamnose-binding lectins (RBLs) in channel catfish, Ictalurus punctatus: Characterization and expression profiling in mucosal tissues. Dev. Comp. Immunol. 44 (2), 320-331 (2014).
  35. Phelps, R. P., et al. Effects of temperature on the induced spawning of channel catfish and the production of channel× blue catfish hybrid fry. Aquaculture. 273 (1), 80-86 (2007).
  36. Poole, W., Dillane, M. Estimation of sperm concentration of wild and reconditioned brown trout, Salmo trutta L. Aquacult. Res. 29 (6), 439-445 (1998).
  37. Billard, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reprod. Nutr. Dev. 26 (4), 877-920 (1986).
  38. Coyle, S. D., Durborow, R. M., Tidwell, J. H. . Anesthetics in aquaculture. , (2004).
  39. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nat. Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  40. Armstrong, J., Duhon, S., Malacinski, G. . Developmental Biology of the Axolotl. , 220-227 (1989).
  41. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J. Vis. Exp. (46), (2010).
  42. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055 (2016).
  43. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  44. Silverstein, J. T., Small, B. C., Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. . Biology and Culture of Channel Catfish. 34, 69-94 (2004).
  45. Su, B., et al. Relative effectiveness of carp pituitary extract, luteininzing hormone releasing hormone analog (LHRHa) injections and LHRHa implants for producing hybrid catfish fry. Aquaculture. 372, 133-136 (2013).
  46. Aluru, N., et al. Targeted mutagenesis of aryl hydrocarbon receptor 2a and 2b genes in Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus). Aquat. Toxicol. 158, 192-201 (2015).
  47. Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
  48. Edvardsen, R. B., Leininger, S., Kleppe, L., Skaftnesmo, K. O., Wargelius, A. Targeted mutagenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) using the CRISPR/Cas9 system induces complete knockout individuals in the F0 generation. PLoS ONE. 9 (9), e108622 (2014).
  49. Li, M., et al. Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9. Genética. 197 (2), 591-599 (2014).
  50. Zhong, Z., et al. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp. Sci. Rep. 6, (2016).
  51. Chakrapani, V., et al. Establishing targeted carp TLR22 gene disruption via homologous recombination using CRISPR/Cas9. Dev. Comp. Immunol. 61, 242-247 (2016).
  52. Lim, J., Ghadessy, F. J., Yong, E. A novel splice site mutation in the androgen receptor gene results in exon skipping and a non-functional truncated protein. Mol. Cell. Endocrinol. 131 (2), 205-210 (1997).
  53. Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F. D., Bork, P., Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO Journal. 22 (15), 3960-3970 (2003).
  54. Talerico, M., Berget, S. M. Effect of 5’splice site mutations on splicing of the preceding intron. Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6299-6305 (1990).

Tags

Keywords: CRISPR/Cas9MicroinjectionChannel CatfishIctalurus PunctatusGene EditingTICAM1RBLBroodstock SelectionSpawningLHRHAHormone InjectionEmbryoProtocolFunctional Genomics
check_url/pt/56275?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D., Page-McCaw, P., Chen, W., Michel, M., Cone, R., Dunham, R. Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing. J. Vis. Exp. (131), e56275, doi:10.3791/56275 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image