Mikroskop är en vanlig laboratorium teknik används för att leverera en liten mängd av ett ämne som DNA, RNA, proteiner och andra makromolekyler i celler eller embryon genom ett glas kapillär¹. Mikroskop utförs med specialutrustning setup inklusive en microinjector, micromanipulator och en Mikroskop². Tekniken har använts av forskare att genetiskt modifiera många organismer genom generationen av transgenics, gen knockouts och genterapi, med syftet att förstå dynamiken i intracellulära komponenter^{3,4 , 5}.

Kanal havskatt (Ictalurus punctatus) är den mest populära havskatt arten i vattenbruket och fritidsfiske verksamhet i USA. Det finns ett ökat behov att studera funktionsgenomik i kanal havskatt och sekvensering av hela genomet hos kanal havskatt ökar nyttan av senaste framstegen i genomet redigering verktyg^6,7. Förstå geners funktion skulle inte bara berika den forskning som bedrivs på havskatt, men kan också leda till effektivare genetisk förbättringsprogram att förbättra branschens havskatt. När kritiska gener för en given egenskap av intresse har identifierats, kan de användas till att genetiskt förbättra havskatt produktion genom gen editering för att skapa fördelaktiga alleler, urval för dessa alleler, undertrycka de skadliga alleler, överföra de fördelaktiga allelerna genom genmodifiering, eller någon kombination av dessa alternativ. Att kombinera de bästa generna för olika kommersiellt fördelaktigt drag från olika arter i en fisk skulle avsevärt förbättra produktivitet och lönsamhet av fisk produktion verksamhet⁸.

Gen knockout är en direkt metod att studera gen funktioner i vivo. Mutationer på DNA-nivå kommer att ärvas av kommande generationer som kommer att underlätta studiet av deras effekter i olika generationer. Olika genomet redigeringsverktyg har utvecklade inklusive zink finger nukleotider (motvilligt), transkription aktivator-liknande effektor nukleaser (TALENs), och klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner/CRISPR-associerade protein 9 (CRISPR/Cas9 ) system^9,10,11,12.

CRISPR/Cas9 systemet är ett kraftfullt och effektivt verktyg som har använts för att redigera genomisk DNA-sekvenser som bland annat gene knockout i fisk genom RNA-guidad platsspecifika DNA klyvning^5,13. Systemet består av en guide-RNA (gärna), som bestämmer den rikta sekvensen i arvsmassan och en DNA endonukleasenzymet, Cas9. CRISPR/Cas9 systemet kan vara utformade för att rikta någon sekvens i genomet med flera fördelar över motvilligt och TALENs: (1) lägre kostnad (2) enklare teknik (3) mer specifik bindning av guide RNA till målet sekvensen, och minskad off-target mutationer (4) flera sekvenser kan riktas med olika gärna i samma tid (5) hög mutagenes takt i gener som inte kunde vara muterad av TALENs och (6) förbättrad könsceller dataöverföringen klassar av mutationer för upp till 6 gånger jämfört med motvilligt och TALENs^{14, 15,16,17,18}.

Den huvudsakliga alternativa metoden för Mikroskop är elektroporation, där elektriska impulser tillämpas på embryon eller celler att öka membran permeabilitet och upptaget av biologiska molekyler^19,20. Flera transgen fisk genererades med elektroporation såsom medaka (Oryzias latipes), zebrafisk (Danio rerio), chinook lax (Oncorhynchus tshawytscha), kanal havskatt, havsruda (Sparus sarba), och vanlig karp (Cyprinus carpio)^{21,22,23,24,25,26}.

Elektroporation har använts för att leverera plasmid DNA, RNA och Cas9 protein för genen knockout. I däggdjursceller Cas9/gärna plasmid DNA, Cas9 mRNA/gärna och Cas9 protein/gärna komplex levererades med elektroporation och mutagenes var högsta använda Cas9 protein/gärna komplex för de flesta elektroporation villkor testade²⁷. I den ascidian Ryggsträngsdjur (Ciona intestinalis) var TALENs uttrycker konstruktioner electroporated i befruktade ägg att inducera knockout av flera gener²⁸. Motvilligt att uttrycka plasmid konstruktioner var electroporated att slå ut luteiniserande hormon i kanal havskatt²⁹. Men när förs in i cellen, plasmid konstruktioner måste transkriberas till RNA och översättas till funktionella proteiner innan de kan rikta den önskade DNA-sekvens, vilket sannolikt skulle fördröja tiden för mutagenes jämfört med Mikroskop av RNA / protein. Som ett embryo utvecklas, ökar fördröjd mutagenes mosaicism av injicerade grundare. Transgena uttrycket är dessutom osannolikt att uppnå uttryck möjligt med Mikroskop, sänka mutagenes effektivitet.

Som ett medel för att införa genomet redigeringsverktyg i celler, har Mikroskop flera fördelar jämfört med elektroporation. Genomet redigering molekyler kan föras på ett tillförlitligt sätt in celler eller embryon genom Mikroskop³⁰. Mindre injektion material behövs. Det är lätt att fastställa beloppen av materiellt injiceras. Högre mutation priser med låg mosaicism i grundare fisken kan vara uppnått som skulle förbättra könsceller överföring av mutationer i F₁. Färre grundare fisk behöver analyseras för att producera den första generationen, på grund av den högsta mutationshastighet. I elektroporation behöver mer grundare fisk analyseras som kommer att öka kostnaderna. Överlevnaden av kanal havskatt microinjected embryon är dock lägre än electroporated sådana, men detta kan lösas genom att injicera fler embryon^31,32. I kanal havskatt, överlevnad av äggula-microinjected embryon varierade mellan 16 och 55%, beroende på de gener som riktas och doseringen av gärna/Cas9 protein³².

Regelbundna Mikroskop av havskatt embryon är tekniskt krävande och tidsödande, men en snabb och effektiv CRISPR/Cas9 protein Mikroskop protokoll presenteras för kanal havskatt embryon. Detta protokoll kräver mindre tid och expertis eftersom CRISPR/Cas9 protein lösningen injiceras i äggulan i en cell embryon. Hundratals befruktade ägg kan injiceras i 1 h (ungefär den tid som behövs för den första celldelningen förekommer). För att validera protokollet, slogs två känslighet-relaterade sjukdomsgener ut i kanal havskatt, toll/interleukin 1 receptor domän-innehållande adapter molekyl (TICAM1) genen och rhamnos bindning lectin (RBL) genen. TICAM 1 är involverad i den signalväg som initierats av toll-liknande receptorer (TLR) 3. I kanal havskatt var TICAM 1 dramatiskt uppreglerad efter Bakterieutmaningen med Edwardsiella ictaluri, medan det var nedreglerade i blå havskatt, en art som är resistent till E. ictaluri³³. RBL spelar en viktig roll i tidiga infektion med Flavobacterium columnare, vilka smittämnen av columnaris sjukdom, där akut och robust uppreglering spelades in i en columnaris-mottagliga kanal havskatt stam jämfört med en columnaris-resistent stam³⁴.