Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing
Summary
Se presenta un protocolo de microinyección simple y eficiente para la edición de genes en embriones de bagre de canal usando el sistema CRISPR/Cas9. En este protocolo, guía RNAs y proteínas Cas9 fueron microinyectados en la yema de una célula de embriones. Este protocolo ha sido validada por la anulación de dos genes relacionados con la inmune de bagre de canal.
Abstract
Se ha secuenciado el genoma completo del bagre de canal, Ictalurus punctatus, conduciendo a mayores oportunidades para estudiar la función genética de bagre de canal. Golpe de gracia del gene se ha utilizado para el estudio de estos genes funciones en vivo. El cluster regularmente otro proteínas cortas repeticiones palindrómico/CRISPR asociado 9 (CRISPR/Cas9) el sistema es una potente herramienta para editar secuencias genómicas de ADN para alterar la función génica. Mientras que el enfoque tradicional ha sido introducir CRISPR/Cas9 mRNA en los embriones de la célula a través de microinyección, esto puede ser un proceso lento e ineficiente en el bagre. Aquí, se describe un protocolo detallado para microinyección de embriones de bagre de canal con CRISPR/Cas9 proteína. Brevemente, óvulos y espermatozoides fueron recogida y luego artificial fertilización realizada. Los huevos fertilizados se transfirieron a una placa de Petri que contenga solución de Holtfreter. Volumen de inyección fue calibrado y luego guía RNAs/Cas9 dirigido a los toll/interleukin-1 dominio-que contienen adaptador (TICAM 1) de la molécula del gene del receptor y ramnosa Unión lectina (RBL) gene fueron microinyectados en la yema de los embriones de una célula. El golpe de gracia del gene era acertado como indels fueron confirmados por secuenciación del ADN. Las alteraciones de la secuencia de la proteína prevista debido a estas mutaciones incluyen mutágeno ‘ frameshift ‘ y truncarán de la proteína debido a codones de parada prematura.
Introduction
Microinyección es una técnica de laboratorio común utilizada para entregar una pequeña cantidad de una sustancia tales como DNA, RNA, proteínas y otras macromoléculas en células o embriones a través de un capilar de vidrio1. Microinyección se realiza mediante la instalación de equipos especiales incluyendo un microinyector, instrumental quirúrgico y un microscopio2. La técnica se ha utilizado por los investigadores para modificar genéticamente muchos organismos a través de la generación de transgénicos, knockouts de genes y terapia genética, con el objetivo de comprender la dinámica de componentes intracelulares3,4 , 5.
El bagre de canal (Ictalurus punctatus) es la especie más popular del bagre en la acuicultura y las actividades de pesca recreativa en los Estados Unidos. Hay una creciente necesidad de estudio de genómica funcional en bagre de canal, y la secuencia del genoma completo de bagre de canal aumenta la utilidad de los recientes avances en genoma edición herramientas6,7. Comprender la función del gen no sólo enriquecería la investigación que se lleva a cabo en el bagre, pero también podría conducir a programas de mejoramiento genético más efectivos para mejorar la industria del bagre. Una vez que se identifican genes críticos para un determinado rasgo de interés, pueden ser utilizados para mejorar genéticamente la producción de bagre a través de la edición del genoma para generar alelos beneficiosos, selección de estos alelos, suprimiendo los alelos perjudiciales, transferencia de los alelos beneficiosos a través de la transgénesis, o alguna combinación de estas opciones. Combinar los mejores genes para diferentes características comercialmente beneficiosos de diferentes especies de una peces mejoraría grandemente la productividad y rentabilidad de las operaciones de producción de pescado8.
Knockout de genes es un método directo para el estudio de las funciones del gene in vivo. Mutaciones a nivel de ADN serán heredadas por las generaciones futuras que facilitarán el estudio de sus efectos en diferentes generaciones. Herramientas de edición diferentes del genoma han sido desarrollados incluyendo zinc finger nucleasas (ZFNs), transcripción nucleasas activador como efectoras (TALENs) y agrupadas regularmente otro corto palindrómico repeticiones/CRISPR-proteína asociada 9 (CRISPR/Cas9 ) sistema9,10,11,12.
El sistema CRISPR/Cas9 es una herramienta potente y eficaz que se ha utilizado para editar secuencias genómicas de ADN incluyendo knockout de genes de peces a través de RNA-dirigida específica escote de DNA5,13. El sistema consta de un RNA de la guía (gRNA), que determina la secuencia específica en el genoma y una enzima endonucleasa de ADN, Cas9. El sistema CRISPR/Cas9 puede diseñarse para cualquier secuencia en el genoma con varias ventajas sobre ZFNs y TALENs de destino: (1) menor costo de ingeniería (2) más fácil Unión (3) más específica de RNA guía de la secuencia Diana y reducido objetivo mutaciones (4) secuencias múltiples pueden ser dirigidas con gRNA diferentes en la misma proporción de tiempo (5) alta mutagénesis en los genes que podrían no ser transformado por TALENs y (6) tasa de transmisión mejorada del germline de mutaciones para hasta doblez 6 comparado con ZFNs y TALENs14, 15,16,17,18.
El principal método alternativo para la microinyección es electroporación, en el cual se aplican impulsos eléctricos a embriones o células para aumentar la permeabilidad de la membrana y la absorción de moléculas biológicas19,20. Varios peces transgénicos se generaron usando electroporación como medaka (Oryzias latipes), pez cebra (Danio rerio), salmón chinook (Oncorhynchus tshawytscha), bagre, dorada (Sparus sarba), y común carpa (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.
La electroporación se ha utilizado para ofrecer proteína de DNA, RNA y Cas9 de plásmido por golpe de gracia del gene. En células de mamífero, Cas9/gRNA plásmido ADN Cas9 mRNA/gRNA y complejos de la proteína/gRNA Cas9 fueron entregados mediante electroporación y las tarifas de mutagénesis fueron mayores con complejos de proteínas/gRNA Cas9 para más electroporación condiciones probadas27. En el cordado de la coloración (Savignyi intestinalis), TALENs expresar construcciones fueron electroporated en los huevos fertilizados para inducir knockout de genes múltiples28. ZFNs expresando plásmido construcciones fueron electroporated para noquear a la hormona luteinizante en el bagre de canal29. Sin embargo, una vez introducidos en la célula, plásmido construcciones deberá ser transcrito a RNA y traducido a proteínas funcionales antes de que puede apuntar la secuencia de ADN deseada, que probablemente retrasaría el momento de la mutagénesis en comparación con microinyección del ARN / proteína. Como el desarrollo de un embrión, mutagénesis tardía aumenta el mosaicism de fundadores inyectados. Además, la expresión transgénica es poco probable alcanzar el nivel de expresión posible con microinyección, bajando la eficiencia de mutagénesis.
Como un medio para introducir herramientas de edición del genoma en las células, microinyección tiene varias ventajas sobre electroporación. Moléculas de edición genómica puede introducirse confiablemente en células o embriones mediante microinyección30. Se necesita menos material de inyección. Es fácil determinar las cantidades de material inyectado. Mayor mutación tarifas con mosaicism bajo en los peces del fundador pueden ser alcanzado que mejoraría del germline transmisión de mutaciones a F1. Menos peces fundador deben ser analizados para producir la primera generación, debido a la mayor tasa de mutación. En electroporación, peces fundador deben analizarse que aumentarán los costos. Sin embargo, la supervivencia de los embriones microinyectados de bagre de canal es menor que electroporated que, aunque esto se puede solucionar mediante la inyección de más embriones31,32. En bagre de canal, la supervivencia de los embriones microinyectados yema osciló entre 16 y 55%, dependiendo de los genes blanco y la dosis de proteína de gRNA/Cas932.
Regular microinyección de embriones de bagre es técnicamente exigente y mucho tiempo, sin embargo, un rápido y eficaz protocolo de microinyección CRISPR/Cas9 proteína se presenta para embriones de bagre de canal. Este protocolo requiere menos tiempo y experiencia ya que la solución de proteína CRISPR/Cas9 se inyecta en la yema de uno de embriones de células. Cientos de huevos fecundados se pueden inyectar en 1 h (aproximadamente el tiempo necesario para que la primera división celular que se produzca). Para validar el protocolo, dos genes relacionados con la susceptibilidad de la enfermedad fueron eliminados en bagre de canal, toll/interleukin 1 gene del receptor del dominio-que contienen adaptador molécula (TICAM1) y el gene de lectinas (RBL) obligatorio de ramnosa. TICAM 1 participa en la vía de señalización iniciada por el receptor de tipo toll (TLR) 3. En bagre de canal, TICAM 1 fue significativamente upregulated después del desafío bacteriano con Edwardsiella ictaluri, mientras que fue regulada en bagre azul, una especie resistente E. ictaluri33. RBL desempeña un papel importante en la infección temprana con Flavobacterium columnare, el agente causativo de la enfermedad columnaris, donde aguda y robusta upregulation se registró en una cepa susceptible columnaris bagre de canal en comparación con un cepa resistente columnaris34.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se presentó un protocolo detallado para microinyección de embriones de bagre de canal para lograr el golpe de gracia del gene. Inyección de proteína CRISPR/Cas9 en la yema de huevo es mucho más sencilla, ahorra tiempo y no requiere formación amplia en comparación con microinjecting el blastodisc del embrión de una célula, que es la técnica común para la mayoría de la transferencia de genes y gene edición con pescado 30 , 42. el protocolo actual demos…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por premio de USDA-NIFA 2015-67015-23488 a Roger Cone. Los autores agradecen a Dr. Ronald Phelps para la descripción de los criterios de selección común cría en el video. Ahmed Elaswad y Karim Khalil gustaría agradecer egipcio Cultural y educativa oficina en Washington para la financiación de su investigación de doctorado.
Materials
| Reproboost implant | Center of Marine Biotechnology | Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females | |
| TRICAINE-S | Western Chemical. Inc. | For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5%, sterile filtered |
| Stereo microscope | Olympus | 213709 | For visualizing the eggs during microinjection |
| Microinjector | ASI-Applied Scientific Instrumentation | Model MPPI-3 | For the delivery of the injection material into the embryos |
| Micromanipulator | ASI-Applied Scientific Instrumentation | Model MM33 | For holding and controlling the movement of the injection needle. |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956.003 | For loading injection solution into microinjection needles. |
| Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 720 | For pulling microinjection needles |
| Cas9 protein | PNA Bio Inc. | CP01 | Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes. |
| Expand High FidelityPLUS PCR System | Roche Diagnostics, USA | For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation | |
| Borosilicate glass capillaries | Fisher Scientific | 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles. | |
| Petri dish | VWR | 25384-302 | For holding the embryos during the microinjection. |
| Crisco | The J.M. Smucker Company | Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. | |
| Holtfreter`s solution | Home Made | 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. | |
| Doxycycline hyclate USP (monohydrate) | Letco Medical | 690904 | Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections. |
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