Микроинъекции ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка в канал сома, сомик punctatus, эмбрионы для редактирования гена
Summary
Простой и эффективный микроинъекции протокол для гена редактирования в Канальный сомик эмбрионов, с помощью системы ТРИФОСФАТЫ/Cas9 представлен. В этом протоколе, руководство РНК и белка Cas9 были microinjected в желток одного клеток эмбрионов. Этот протокол был утвержден путем стучать вне двух Канальный сомик иммунной связанных генов.
Abstract
Полный геном канального сома, сомик punctatus, была последовательной, приводит к более широкие возможности для изучения функции гена канального сома. Нокаут гена был использован для изучения функции этих генов в естественных условиях. Кластеризованный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется/ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (ТРИФОСФАТЫ/Cas9) система представляет собой мощный инструмент, используемый для редактирования геномных последовательностей ДНК изменить функции гена. В то время как традиционный подход был ввести ТРИФОСФАТЫ/Cas9 мРНК в одну ячейку эмбрионов путем микроинъекции, это может быть медленным и неэффективным процессом в Сома. Здесь описан подробный протокол для микроинъекции канального сома эмбрионов с ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка. Вкратце яйца и спермы были собраны и затем искусственное оплодотворение выполняется. Оплодотворенные яйца были переведены в чашку Петри, содержащие Holtfreter в раствор. Объем впрыска был откалиброван и затем руководство РНК/Cas9 ориентация которую платных/интерлейкина 1 рецептора домена содержащих адаптер молекулы (TICAM 1) гена и рамноза привязки Лектин (RBL) гена были microinjected в желток одного клеток эмбрионов. Нокаут гена был успешным, как indels были подтверждены секвенирования ДНК. Изменения последовательности предсказал белка из-за эти мутации включены фреймшифт и усечение белка из-за преждевременной остановки кодонов.
Introduction
Микроинъекции является общей лаборатории метод, используемый для доставки небольшое количество вещества, такие как ДНК, РНК, белков и других макромолекул в клетки или эмбрионов через капиллярные стеклянные1. Микроинъекции осуществляется с помощью установки специального оборудования, включая microinjector, микроманипулятор и Микроскоп2. Этот метод был использован исследователями генетически изменить многих организмов через поколение мутация гена нокауты и генной терапии, с целью понимания динамики внутриклеточных компонентов3,4 , 5.
Канальный сомик (сомик punctatus) является наиболее популярных видов сома в аквакультуре и любительского рыболовства в Соединенных Штатах. Существует возрастает необходимость изучения функциональной геномики в канального сома, и секвенирования генома полный канал Сома повышает полезность последних достижений в геноме редактирования инструменты6,7. Понимание функции гена не только обогатит исследований, которые проводятся на сома, но также может привести к более эффективные программы улучшения генетических качеств для расширения индустрии сом. После выявления критических генов для данного признака интерес, они могут использоваться для генетически улучшения производства сом посредством изменения генома для создания полезных аллелей, выбор для этих аллелей, пресечению пагубных аллелей, передача благотворное аллели через трансгенез, или некоторая комбинация этих вариантов. Объединяя лучшие гены для различных коммерчески выгодные черты из различных видов в одной рыбы позволит значительно повысить производительность и рентабельность операций производства рыбы8.
Нокаут гена является прямой метод для изучения функций генов в естественных условиях. Мутации на уровне ДНК будет наследоваться будущих поколений, которые будут способствовать изучению их последствий в разных поколений. Инструменты редактирования разных генома были развитые включая цинковый палец nucleases (ZFNs), транскрипции эффекторных активатор как nucleases (Таленс) и кластерные регулярно interspaced короткие палиндром повторяется/ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (ТРИФОСФАТЫ/Cas9 ) системы9,10,,1112.
ТРИФОСФАТЫ/Cas9 система является мощный и эффективный инструмент, используемый для редактирования геномных последовательностей ДНК, включая Нокаут гена в рыбы через РНК руководствуясь участкам ДНК расщепления5,13. Система состоит из руководство РНК (gRNA), который определяет целевой последовательности генома и ДНК эндонуклеазы фермента, Cas9. ТРИФОСФАТЫ/Cas9 система может быть сконструирована для любой последовательности генома с рядом преимуществ перед ZFNs и Таленс: (1) ниже стоимости (2) легче инженерных (3) более конкретной привязки руководство РНК последовательности целевых объектов и снижение пробить мутации (4) несколько последовательностей могут быть направлены с различными gRNA такими же темпами время (5) высокая мутагенеза в генах, которые могут не быть мутировал Таленс и (6) скорость передачи улучшение герминальных мутаций для до шестикратно по сравнению с ZFNs и Таленс14, 15,16,17,18.
Основные альтернативный метод для микроинъекции – электропорация, в котором применяются электрические импульсы эмбрионов или ячейки для увеличения проницаемости мембран и освоения биологических молекул19,20. Несколько трансгенных рыбы были созданы с помощью электропорации оризии (Oryzias latipes), данио рерио (Danio рерио), чавычи (Oncorhynchus tshawytscha), канального сома, морской лещ (Sparus Сарбой), и Общие Карп (Cyprinus Карпио)21,,2223,24,25,26.
Электропорация был использован для доставки плазмида ДНК, РНК и Cas9 белка для Нокаут гена. В mammalian клетках, Cas9/gRNA плазмидной ДНК, Cas9 мРНК/gRNA и Cas9 белка/gRNA комплексы были доставлены с помощью электропорации и мутагенез ставки были высокими, используя Cas9 белка/gRNA комплексы для большинства условий испытания электропорации27. В асцидии Хордовые (Ciona интестиналис) electroporated в оплодотворенных яиц побудить нокаут нескольких генов28. выражая конструкции Таленс ZFNs, выражая плазмидные конструкции были electroporated выбить лютеинизирующего гормона в Канальный сомик29. Однако, после того, как введены в ячейку, плазмидные конструкции нужно будет быть транскрибируется в РНК и переведено на функциональных белков, прежде чем они могут быть нацелены нужный последовательности ДНК, который вероятно задержит время мутагенеза, по сравнению с микроинъекции РНК / белка. Как развивается эмбрион, задержка мутагенеза увеличивает мозаичностью вводят учредителей. Кроме того трансгенных выражение маловероятно для достижения уровня выражения с микроинъекции, снижение эффективности мутагенеза.
Как средства для внедрения инструментов редактирования генома в клетки микроинъекции имеет ряд преимуществ над электропорации. Геном редактирования молекул можно надежно вводят в клетки или эмбрионов путем микроинъекции30. Требуется меньше материала инъекций. Это легко определить количество материала вводили. Выше мутации, ставки с низкой мозаичностью основатель рыб может быть достигнуто, который позволит улучшить передачу герминальных мутаций F1. Меньше основатель рыбы должны быть проанализированы для производства первого поколения, благодаря более высокой скорости мутации. В электропорация больше основатель рыбы должны быть проанализированы которые увеличат расходы. Однако выживаемости эмбрионов канального сома microinjected меньше чем electroporated, хотя это может быть преодолено путем инъекций больше эмбрионов31,32. Канальный сомик, выживаемости эмбрионов желток microinjected, варьировались от 16 до 55%, в зависимости от гены мишенью и дозировка gRNA/Cas9 белок32.
Регулярное микроинъекции Сома эмбрионов является технически сложным и много времени, однако, быстрое и эффективное ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка микроинъекции протокол представляется для канального сома эмбрионов. Этот протокол требует меньше времени и опыта, поскольку вводят раствор белка ТРИФОСФАТЫ/Cas9 в желток одного клеток эмбрионов. Сотни оплодотворенных яиц может быть введен в 1 h (примерно время, необходимое для первого деления клеток происходят). Чтобы проверить протокол, два заболевания связанные с восприимчивость гены были выбиты в канального сома, платных/интерлейкина 1 домена содержащих адаптер молекулы (TICAM1) ген рецептора и рамноза привязки Лектин (RBL) ген. TICAM 1 участвует в сигнальный путь, начатый Толл подобный рецептор (TLR) 3. В канального сома TICAM 1 была резко upregulated после бактериальной вызов с Edwardsiella ictaluri, в то время как он был downregulated в blue сома, видов, устойчивых к э. ictaluri33. RBL играет важную роль в ранней инфекции с флавобактерии Колончатая, возбудителя болезни columnaris, где острые и надежные upregulation был записан в columnaris чувствительными канального сома штамма, по сравнению с 34columnaris резистентными штаммами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Был представлен подробный протокол для микроинъекции канального сома эмбрионов для достижения Нокаут гена. Инъекции ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка в желток намного проще, экономит время и не требует обучения по сравнению с microinjecting blastodisc один клеток эмбриона, который является самым распростране?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось USDA-НИФА награду 2015-67015-23488 Роджер конуса. Авторы благодарят Доктор Рональд Phelps для описания критериев выводок фондовый отбора в видео. Ахмед Elaswad и Карима Халиля хотел бы поблагодарить египетские культурные и образовательные бюро в Вашингтон Округ Колумбия, для финансирования их кандидат исследований.
Materials
| Reproboost implant | Center of Marine Biotechnology | Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females | |
| TRICAINE-S | Western Chemical. Inc. | For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5%, sterile filtered |
| Stereo microscope | Olympus | 213709 | For visualizing the eggs during microinjection |
| Microinjector | ASI-Applied Scientific Instrumentation | Model MPPI-3 | For the delivery of the injection material into the embryos |
| Micromanipulator | ASI-Applied Scientific Instrumentation | Model MM33 | For holding and controlling the movement of the injection needle. |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956.003 | For loading injection solution into microinjection needles. |
| Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 720 | For pulling microinjection needles |
| Cas9 protein | PNA Bio Inc. | CP01 | Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes. |
| Expand High FidelityPLUS PCR System | Roche Diagnostics, USA | For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation | |
| Borosilicate glass capillaries | Fisher Scientific | 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles. | |
| Petri dish | VWR | 25384-302 | For holding the embryos during the microinjection. |
| Crisco | The J.M. Smucker Company | Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. | |
| Holtfreter`s solution | Home Made | 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. | |
| Doxycycline hyclate USP (monohydrate) | Letco Medical | 690904 | Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections. |
Referências
- Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
- Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. . Components of a microinjection system. , 935-939 (2011).
- Du, S. J., et al. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an "all fish" chimeric growth hormone gene construct. Nat. Biotechnol. 10 (2), 176-181 (1992).
- Davis, B., Brown, D., Prokopishyn, N., Yannariello-Brown, J. Micro-injection-mediated hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (4), 412-419 (2000).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Liu, Z., et al. The channel catfish genome sequence provides insights into the evolution of scale formation in teleosts. Nat. Commun. 7, (2016).
- Abdelrahman, H., et al. Aquaculture genomics, genetics and breeding in the United States: current status, challenges, and priorities for future research. BMC Genomics. 18 (1), 191 (2017).
- Dunham, R. A. . Aquaculture and Fisheries Biotechnology : Genetic Approaches. , (2011).
- Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
- Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 41 (20), 9584-9592 (2013).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Li, M., Zhao, L., Page-McCaw, P. S., Chen, W. Zebrafish genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Trends Genet. 32 (12), 815-827 (2016).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841 (1982).
- Powers, D. A., et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 301-308 (1991).
- Inoue, K., et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differ. Dev. 29 (2), 123-128 (1990).
- Buono, R., Linser, P. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 271-275 (1991).
- Sin, F., et al. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture. 117 (1-2), 57-69 (1993).
- Dunham, R. A., et al. Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus possessing cecropin genes. Mar. Biotechnol. 4 (3), 338-344 (2002).
- Lu, J. K., Fu, B. H., Wu, J. L., Chen, T. T. Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods. Mar. Biotechnol. 4 (3), 328-337 (2002).
- Cheng, Q., et al. Interaction of diet and the masou salmon Δ5-desaturase transgene on Δ6-desaturase and stearoyl-CoA desaturase gene expression and N-3 fatty acid level in common carp (Cyprinus carpio). Transgenic Res. 23 (5), 729-742 (2014).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 208, 44-53 (2015).
- Treen, N., et al. Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts by TALEN electroporation provide new approaches to investigating gene function in Ciona. Development. 141 (2), 481-487 (2014).
- Qin, Z., et al. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Mar. Biotechnol. 18 (2), 255-263 (2016).
- Qin, Z. . Gene editing of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and gonadotropin-releasing hormone genes to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 technologies. , (2015).
- Dunham, R. A., Winn, R. N., Pinkert, C. A. . Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. , 308-336 (2014).
- Elaswad, A. . Genetic technologies for disease resistance research and enhancement in catfish. , (2016).
- Baoprasertkul, P., Peatman, E., Somridhivej, B., Liu, Z. Toll-like receptor 3 and TICAM genes in catfish: species-specific expression profiles following infection with Edwardsiella ictaluri. Immunogenetics. 58 (10), 817-830 (2006).
- Thongda, W., Li, C., Luo, Y., Beck, B. H., Peatman, E. L-rhamnose-binding lectins (RBLs) in channel catfish, Ictalurus punctatus: Characterization and expression profiling in mucosal tissues. Dev. Comp. Immunol. 44 (2), 320-331 (2014).
- Phelps, R. P., et al. Effects of temperature on the induced spawning of channel catfish and the production of channel× blue catfish hybrid fry. Aquaculture. 273 (1), 80-86 (2007).
- Poole, W., Dillane, M. Estimation of sperm concentration of wild and reconditioned brown trout, Salmo trutta L. Aquacult. Res. 29 (6), 439-445 (1998).
- Billard, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reprod. Nutr. Dev. 26 (4), 877-920 (1986).
- Coyle, S. D., Durborow, R. M., Tidwell, J. H. . Anesthetics in aquaculture. , (2004).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nat. Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- Armstrong, J., Duhon, S., Malacinski, G. . Developmental Biology of the Axolotl. , 220-227 (1989).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J. Vis. Exp. (46), (2010).
- Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055 (2016).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Silverstein, J. T., Small, B. C., Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. . Biology and Culture of Channel Catfish. 34, 69-94 (2004).
- Su, B., et al. Relative effectiveness of carp pituitary extract, luteininzing hormone releasing hormone analog (LHRHa) injections and LHRHa implants for producing hybrid catfish fry. Aquaculture. 372, 133-136 (2013).
- Aluru, N., et al. Targeted mutagenesis of aryl hydrocarbon receptor 2a and 2b genes in Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus). Aquat. Toxicol. 158, 192-201 (2015).
- Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
- Edvardsen, R. B., Leininger, S., Kleppe, L., Skaftnesmo, K. O., Wargelius, A. Targeted mutagenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) using the CRISPR/Cas9 system induces complete knockout individuals in the F0 generation. PLoS ONE. 9 (9), e108622 (2014).
- Li, M., et al. Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9. Genética. 197 (2), 591-599 (2014).
- Zhong, Z., et al. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp. Sci. Rep. 6, (2016).
- Chakrapani, V., et al. Establishing targeted carp TLR22 gene disruption via homologous recombination using CRISPR/Cas9. Dev. Comp. Immunol. 61, 242-247 (2016).
- Lim, J., Ghadessy, F. J., Yong, E. A novel splice site mutation in the androgen receptor gene results in exon skipping and a non-functional truncated protein. Mol. Cell. Endocrinol. 131 (2), 205-210 (1997).
- Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F. D., Bork, P., Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO Journal. 22 (15), 3960-3970 (2003).
- Talerico, M., Berget, S. M. Effect of 5’splice site mutations on splicing of the preceding intron. Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6299-6305 (1990).
