Microinjeção é uma técnica comum de laboratório usada para entregar uma pequena quantidade de uma substância como DNA, RNA, proteínas e outras macromoléculas em células ou de embriões através de um capilar de vidro¹. Microinjeção é executada usando a instalação de equipamentos especiais, incluindo um microinjector e um microscópio²micromanipulador. A técnica tem sido usada por pesquisadores para modificar geneticamente muitos organismos através da geração de transgênicos, gene nocautes e terapia genética, com o objectivo de compreensão da dinâmica dos componentes intracelulares^{3,4 , 5}.

O bagre do canal (Ictalurus punctatus) é as mais populares espécies de bagres na aquicultura e actividades de pesca recreativa nos Estados Unidos. Há uma crescente necessidade de estudar a genómica funcional em bagre do canal, e o sequenciamento do genoma completo de bagre do canal aumenta a utilidade dos avanços recentes em^6,de ferramentas de edição do genoma⁷. Compreender a função do gene teria não só enriquecer a pesquisa que está sendo realizada no peixe-gato, mas também pode levar à programas de melhoramento genético mais eficazes para melhorar a indústria de peixe-gato. Uma vez identificados os genes críticos para uma determinada característica de interesse, eles podem ser usados para melhorar geneticamente produção de bagre através do genoma de edição para gerar alelos benéficos, seleção para estes alelos, suprimindo os alelos prejudiciais, transferência os alelos benéficos através de transgênese, ou uma combinação destas opções. Combinar os melhores genes para diferentes características comercialmente vantajoso de espécies diferentes em um peixe extremamente iria melhorar a produtividade e rentabilidade da produção de peixe operações⁸.

Nocaute do gene é um método direto para o estudo de funções do gene em vivo. Mutações no nível do DNA serão herdadas pelas gerações futuras, que facilitarão o estudo de seus efeitos em diferentes gerações. Ferramentas de edição de genoma diferentes foram desenvolvidos incluindo zinco dedo as nucleases (ZFNs), transcrição nucleases activator como efetoras (TALENs) e agrupado regularmente intercalada curta palíndromo repetições/CRISPR-proteína associada 9 (CRISPR/Cas9 ) sistema^9,10,11,12.

O sistema CRISPR/Cas9 é uma ferramenta poderosa e eficiente que tem sido usada para editar sequências genomic DNA, incluindo o nocaute do gene em peixes através de RNA guiadas site-specific DNA clivagem^5,13. O sistema consiste de um RNA guia (gRNA), que determina a sequência alvo do genoma e uma enzima endonuclease de DNA, Cas9. O sistema CRISPR/Cas9 pode ser projetado para qualquer sequência no genoma com várias vantagens sobre ZFNs e TALENs-alvo: (1) baixo custo de engenharia (2) mais fácil ligação (3) mais específica do guia do RNA para a sequência do alvo e reduzida mutações fora do alvo (4) várias sequências podem ser direcionadas com gRNA diferente com a mesma taxa de mutagénese alta de tempo (5) nos genes que poderia não ser mutado por TALENs e (6) taxa de transmissão do germline melhorada de mutações para cima para 6-fold quando comparado com ZFNs e TALENs^{14, 15,16,17,18}.

O principal método alternativo para o microinjection é electroporation, no qual os impulsos elétricos são aplicados a embriões ou células para aumentar a permeabilidade da membrana e a absorção de moléculas biológicas^19,20. Vários peixes transgênicos foram gerados usando electroporation como medaka (Oryzias latipes), peixe-zebra (Danio rerio), salmão chinook (Oncorhynchus tshawytscha), bagre de canal, goraz (amiláceos sarba), e comum carpa (Cyprinus carpio)^{21,22,23,24,25,26}.

Electroporation serviu para fornecer proteína de DNA, RNA e Cas9 plasmídeo nocaute do gene. Em células de mamíferos, Cas9/gRNA plasmídeo, Cas9 mRNA/gRNA e complexos de proteína/gRNA Cas9 foram entregues usando electroporation e as taxas de mutagênese foram mais altos usando Cas9 proteína/gRNA complexos para a maioria de condições testadas electroporation²⁷. Os Cordados urocordado (Ciona intestinalis), TALENs expressando construções foram electroporated em ovos fertilizados para induzir o nocaute de múltiplos genes²⁸. ZFNs expressando de shRNA construções foram electroporated para nocautear o hormônio luteinizante em bagre do canal²⁹. No entanto, uma vez introduzido na célula, construções de plasmídeo precisará ser transcrito para o RNA e traduzido para proteínas funcionais antes que eles podem direcionar a sequência de DNA desejada, que provavelmente iria atrasar a hora de mutagénese comparado a microinjeção de RNA / proteína. Como um embrião está se desenvolvendo, mutagênese retardada aumenta o mosaicismo dos fundadores injetados. Além disso, expressão transgênica é improvável alcançar o nível de expressão possível com microinjeção, reduzindo a eficiência de mutagénese.

Como um meio para a introdução de ferramentas de edição do genoma em células, microinjeção tem várias vantagens sobre eletroporação. Edição de moléculas de genoma pode ser confiantemente introduzida em células ou de embriões através de microinjeção de³⁰. Menos material de injeção é necessária. É fácil determinar as quantidades de material injetado. Maior mutação taxas com mosaicismo baixa no peixe fundador podem ser alcançado que melhorariam germline transmissão de mutações de F-₁. Menos peixes fundador precisam ser analisado para produzir a primeira geração, devido à maior taxa de mutação. Na eletroporação, mais peixes fundador precisam ser analisado que aumentará os custos. No entanto, a sobrevivência de embriões channel catfish injetadas é inferior a electroporated os, embora isto pode ser superado pela injeção de mais embriões^31,32. Em bagre do canal, sobrevivência de embriões de gema-injetadas variou entre 16 e 55%, dependendo dos genes alvo e a dosagem de proteína gRNA/Cas9³².

Microinjection regular de embriões de peixe-gato é tecnicamente exigente e demorado, no entanto, um protocolo de microinjeção rápido e eficiente CRISPR/Cas9 proteína é apresentado para embriões de bagre do canal. Este protocolo requer menos tempo e experiência desde a solução de proteína CRISPR/Cas9 é injectada a gema de um embriões de célula. Centenas de ovos fertilizados podem ser injetadas em 1h (aproximadamente o tempo necessário para a primeira divisão celular ocorra). Para validar o protocolo, dois genes de suscetibilidade-relacionados de doença foram eliminados em bagre do canal, o gene molécula (TICAM1) do adaptador de domínio-contendo do pedágio/interleucina 1 receptor e o gene de lectina (RBL) de vinculação de ramnose. TICAM 1 está envolvido na via de sinalização iniciada por receptores do tipo toll (TLR) 3. Em bagre do canal, 1 TICAM foi dramaticamente upregulated seguindo o desafio bacteriano com Edwardsiella ictaluri, enquanto era ativador em bagre azul, uma espécie resistente à ictaluri E.³³. RBL desempenha um papel importante na infecção precoce com Flavobacterium columnare, o agente causador da doença de columnaris, onde aguda e upregulation robusto foi gravado em uma cepa de bagre de canal columnaris-sensíveis em comparação com um estirpe resistente columnaris³⁴.