Microinjection er en vanlig laboratoriet teknikken brukes til å levere en liten mengde av et stoff som DNA, RNA, protein og andre makromolekyler i celler eller embryo gjennom glass kapillær¹. Microinjection utføres med spesialutstyr installasjonen inkludert en microinjector, micromanipulator og et mikroskop². Teknikken har blitt brukt av forskere genetisk endre mange organismer gjennom generasjon transgenics, gene fortrenging og genterapi, med sikte på å forstå dynamikken i intracellular komponentene^{3,4 , 5}.

Kanalen Gråsteinbit (Ictalurus punctatus) er den mest populære steinbit arten innen akvakultur og fritidsfiske aktiviteter i USA. Det er et økende behov for å studere funksjonell genomforskning i kanalen Gråsteinbit sekvensering av komplett genomet av kanalen Gråsteinbit forbedrer nytten av nylige fremskritt i genomet redigering verktøy^6,7. Forstå gen funksjon ville ikke bare berike forskningen som blir gjennomført steinbit, men kan også føre til mer effektiv genetisk forbedring programmer å forbedre steinbit industrien. Når kritiske gener for en gitt egenskap av interesse er identifisert, kan de brukes til å forbedre genetisk steinbit produksjon gjennom genomet redigering for å generere gunstig alleler, valg for disse alleler, undertrykke de ødeleggende alleler, overføre de gunstige alleler gjennom transgenesis, eller en kombinasjon av disse alternativene. Kombinere beste genene for ulike kommersielt nyttige egenskaper fra ulike arter i en fisk ville forbedre produktiviteten og lønnsomheten av fisk produksjon operasjoner⁸.

Gene knockout er en direkte metode å studere genet funksjoner i vivo. Mutasjoner på DNA nivå vil bli arvet av fremtidige generasjoner som vil lette studiet av deres effekter i ulike generasjoner. Forskjellige genomet redigeringsverktøy er utviklet inkludert sink finger nucleases (ZFNs), transkripsjon aktivator som effektor nucleases (TALENs), og gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar/CRISPR-assosiert protein 9 (CRISPR/Cas9 ) systemet^9,10,11,12.

CRISPR/Cas9 systemet er et kraftig, effektive verktøy som er brukt til å redigere genomisk DNA-sekvenser inkludert gene knockout i fisk til RNA-guidede områdespesifikke DNA cleavage^5,13. Systemet består av en guide (gRNA), som bestemmer målrettet rekkefølgen genomet og en DNA endonuclease enzym, Cas9. CRISPR/Cas9 systemet kan utformes til å målrette en sekvens i genomet med flere fordeler sammenlignet med ZFNs og TALENs: (1) lavere pris (2) lettere engineering (3) mer spesifikke binding av guide RNA til målet sekvensen, og reduserte off-målet mutasjoner (4) flere sekvenser kan være målrettet med forskjellige gRNA på samme tid (5) høyt mutagenese satsen i gener som ikke kunne være mutert ved TALENs, og (6) forbedret germline overføringshastigheten av mutasjoner for opptil 6-fold sammenlignet med ZFNs og TALENs^{14, 15,16,17,18}.

Den viktigste alternative metoden for microinjection er electroporation, der elektriske impulser brukes embryoer eller celler å øke membran permeabilitet og opptaket av biologiske molekyler^19,20. Flere transgene fisk ble generert ved hjelp av electroporation som medaka (Oryzias latipes), sebrafisk (Danio rerio), chinook laks (Oncorhynchus tshawytscha), kanalen Gråsteinbit, Brie (Sparus sarba), og felles karpe (Cyprinus carpio)^{21,22,23,24,25,26}.

Electroporation har blitt brukt til å levere plasmider DNA, RNA og Cas9 protein for genet knockout. I pattedyrceller, Cas9/gRNA plasmider DNA, Cas9 mRNA/gRNA og Cas9 protein/gRNA komplekser ble levert med electroporation og de mutagenese prisene var høyest med Cas9 protein/gRNA komplekser for de fleste electroporation forhold testet²⁷. I ascidian Ryggstrengdyr (Ciona intestinalis) var TALENs uttrykke konstruksjoner electroporated i befruktede egg å indusere knockout flere gener²⁸. ZFNs uttrykke plasmider konstruksjoner var electroporated å slå ut luteiniserende hormon i kanalen Gråsteinbit²⁹. Men når introdusert i cellen, plasmider konstruksjoner må transkribert til RNA og oversatt til funksjonelle proteiner før de kan målrette ønsket DNA sekvensen, som trolig forsinke tiden av mutagenese sammenlignet med microinjection av / protein. Som en fosteret utvikler, øker forsinket mutagenese mosaicism av injisert grunnleggere. I tillegg er transgene uttrykk usannsynlig å oppnå det uttrykket mulig med microinjection, senke mutagenese effektivitet.

Som et middel for å innføre genomet redigeringsverktøyene i celler, har microinjection flere fordeler fremfor electroporation. Genomet redigering molekyler kan bli pålitelig introdusert i celler eller embryo gjennom microinjection³⁰. Mindre injeksjon materiale er nødvendig. Det er lett å bestemme beløpene materiale injisert. Høyere mutasjon priser med lav mosaicism i grunnlegger fisken kan være oppnådd som ville forbedre germline overføring av mutasjoner F₁. Færre grunnlegger fisk må analyseres for å produsere første generasjon, på grunn av høyere Mutasjonshastigheten. I electroporation må mer grunnlegger fisk analyseres som øker kostnadene. Overlevelsen av kanalen Gråsteinbit microinjected embryoer er imidlertid lavere enn electroporated seg, selv om dette kan overvinnes ved å injisere mer embryo^31,32. I kanalen Gråsteinbit, overlevelse av eggeplomme-microinjected embryo varierte fra 16 til 55%, avhengig av gener målrettet og dosering av gRNA/Cas9 protein³².

Vanlige microinjection av steinbit embryo er teknisk krevende og tidkrevende, men en rask og effektiv CRISPR/Cas9 protein microinjection protokoll presenteres for kanalen Gråsteinbit embryoer. Denne protokollen krever mindre tid og ekspertise siden CRISPR/Cas9 protein løsningen injiseres i eggeplomme av én celle embryo. Hundrevis av befruktet egg kan injiseres i 1 h (ca tiden nødvendig for første celledeling oppstår). For å validere protokollen, slått to sykdom mottakelighet-relaterte gener ut i kanalen Gråsteinbit, toll/interleukin 1 reseptor domenet inneholder kort molekyl (TICAM1) genet og rhamnose bindende Lektiner (RBL) genet. TICAM 1 er involvert i signalveien initiert av toll-like reseptor (TLR) 3. I kanalen Gråsteinbit var TICAM 1 dramatisk upregulated etter bakteriell utfordring med Edwardsiella ictaluri, mens det var downregulated i blå steinbit, en art motstandsdyktig til E. ictaluri³³. RBL spiller en viktig rolle i tidlig infeksjon med Flavobacterium columnare, den utløsende agenten for columnaris sykdom, der akutt og solid upregulation ble spilt inn i en columnaris-følsomme kanalen Gråsteinbit belastning sammenlignet med en columnaris-resistent stamme³⁴.