Microiniezione è una comune tecnica di laboratorio utilizzata per distribuire una piccola quantità di una sostanza come DNA, RNA, proteine e altre macromolecole nelle cellule o embrioni attraverso un capillare di vetro¹. Microiniezione viene eseguita utilizzando l’installazione di attrezzature speciali tra cui un microinjector, micromanipolatore e un microscopio². La tecnica è stata utilizzata dai ricercatori per modificare geneticamente molti organismi attraverso la generazione di transgenetica, TNA knockouts genica e la terapia genica, con l’obiettivo di comprendere le dinamiche di componenti intracellulari^{3,4 , 5}.

Il pesce gatto della manica (Ictalurus punctatus) è la specie di pesce gatto più popolare nel settore dell’acquacoltura e attività di pesca sportiva negli Stati Uniti. C’è un crescente bisogno di studiare la genomica funzionale in pesce gatto della manica, e sequenziamento del genoma completo di pesce gatto della manica migliora l’utilità degli avanzamenti recenti nel genoma editing strumenti^6,7. Comprendere la funzione del gene non sarebbe solo arricchire la ricerca che viene condotta sul pesce gatto, ma potrebbe anche portare a programmi di miglioramento genetico più efficaci per migliorare l’industria del pesce gatto. Una volta identificati geni critici per un determinato tratto di interesse, sono utilizzabili per migliorare geneticamente la produzione di pesce gatto attraverso l’editing genomico per generare benefici alleli, selezione di questi alleli, sopprimendo gli alleli dannosi, trasferimento gli alleli benefici attraverso la transgenesi, o qualche combinazione di queste opzioni. Combinando i migliori geni per diversi tratti commercialmente vantaggioso da specie diverse in un pesce notevolmente migliorare la produttività e la redditività di pesce produzione operazioni⁸.

Gene knockout è un metodo diretto per studiare il gene funzioni in vivo. Mutazioni a livello del DNA verranno ereditate dalle generazioni future che faciliteranno lo studio dei loro effetti in diverse generazioni. Strumenti di editing di genoma differenti sono state sviluppate compreso zinco nucleasi a dita (ZFNs), trascrizione nucleasi attivatore-come effettore (TALENs) e cluster regolarmente interspaziata breve palindromica ripetizioni/CRISPR-associati proteina 9 (CRISPR/Cas9 ) sistema^9,10,11,12.

Il sistema CRISPR/Cas9 è uno strumento potente, efficiente che è stato utilizzato per modificare le sequenze di DNA genomic compreso knockout del gene nei pesci attraverso RNA-guida site-specific DNA cleavage^5,13. Il sistema è costituito da un RNA di guida (gRNA), che determina la sequenza mirata nel genoma e un enzima di endonucleasi di DNA, Cas9. Il sistema CRISPR/Cas9 può essere progettato per indirizzare qualsiasi sequenza del genoma con parecchi vantaggi sopra ZFNs e TALENs: (1) abbassare costo (2) più facile di ingegneria (3) più specifica associazione di guida RNA nella sequenza di destinazione e ridotto le mutazioni fuori bersaglio (4) sequenze multiple possono essere mirate con gRNA differente allo stesso tasso di alta mutagenesi di tempo (5) in geni che potrebbero non essere mutato dalla TALENs e (6) Tasso di trasmissione di germline migliorata delle mutazioni per fino a 6 volte rispetto al ZFNs e TALENs^{14, 15,16,17,18}.

Il principale metodo alternativo per il microinjection è elettroporazione, in cui gli impulsi elettrici vengono applicati per gli embrioni o cellule per aumentare la permeabilità della membrana e l’assorbimento di molecole biologiche^19,20. Parecchi pesci transgenici sono stati generati usando elettroporazione come medaka (Oryzias latipes), zebrafish (Danio rerio), chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha), pesce gatto della manica, orata (Sparus sarba), e comuni della carpa (Cyprinus carpio)^{21,22,23,24,25,26}.

L’elettroporazione è stato utilizzato per fornire il plasmide DNA, RNA e Cas9 proteine per knockout del gene. In cellule di mammifero, Cas9/gRNA plasmide DNA, mRNA Cas9/gRNA e complessi proteina/gRNA Cas9 sono stati consegnati usando elettroporazione e i tassi di mutagenesi erano più alti utilizzando complessi proteina/gRNA Cas9 per la maggior parte elettroporazione condizioni testate²⁷. Cordato le Ascidie (Ciona intestinalis), TALENs esprimendo costrutti erano individulamente in uova fecondate per indurre ad eliminazione diretta di più geni²⁸. ZFNs esprimendo plasmide costrutti sono state elettroporate a knock out ormone luteinizzante in pesce gatto della manica²⁹. Tuttavia, una volta introdotto nella cellula, costrutti di plasmide saranno necessario essere trascritti di RNA e convertita in proteine funzionali prima di essi puoi indirizzare la sequenza di DNA desiderata, che sarebbe probabilmente ritardare il tempo di mutagenesi rispetto alla microiniezione di RNA / proteina. Come è lo sviluppo di un embrione, mutagenesi in ritardo aumenta il mosaicism dei fondatori iniettati. Inoltre, espressione transgenica è improbabile per raggiungere il livello di espressione possibile con microiniezione, abbassando l’efficienza di mutagenesi.

Come un mezzo per l’introduzione di strumenti di editing del genoma nelle cellule, microinjection presenta parecchi vantaggi sopra l’elettroporazione. Genoma molecole di editing può essere introdotto in modo affidabile nelle cellule o embrioni attraverso microiniezioni³⁰. Meno materiale di iniezione è necessario. È facile determinare la quantità di materiale iniettato. Mutazione più elevati tassi di mosaicismo basso nel pesce fondatore possono essere raggiunto che migliorerebbe la trasmissione nella linea germinale di mutazioni di F₁. Meno pesce fondatore devono essere analizzati per produrre la prima generazione, a causa del più alto tasso di mutazione. In elettroporazione, più pesce fondatore devono essere analizzati che aumenteranno i costi. Tuttavia, la sopravvivenza degli embrioni microiniettati pesce gatto della manica è inferiore a individulamente quelli, anche se questo può essere superato iniettando più embrioni^31,32. In pesce gatto della manica, la sopravvivenza degli embrioni microiniettati tuorlo ha variato da 16 a 55%, secondo i geni presi di mira e il dosaggio della proteina gRNA/Cas9³².

Microiniezione regolari degli embrioni di pesce gatto è tecnicamente impegnativo e richiede tempo, tuttavia, un protocollo di microinjection di proteine CRISPR/Cas9 rapido ed efficiente è presentato per gli embrioni di pesce gatto della manica. Questo protocollo richiede meno tempo e competenze, poiché la soluzione della proteina CRISPR/Cas9 viene iniettata il tuorlo di embrioni di una cella. Centinaia di uova fecondate possa essere iniettati in 1h (circa il tempo necessario per la divisione delle cellule prima che si verifichi). Per convalidare il protocollo, due geni correlati alla suscettibilità di malattia sono stati eliminati in pesce gatto della manica, il pedaggio/interleukin 1 dominio contenenti adattatore molecola (TICAM1) del gene del ricevitore e del gene di ramnosio binding lectin (RBL). TICAM 1 è coinvolto nella via di segnalazione avviata dal recettore toll-like (TLR) 3. In pesce gatto della manica, TICAM 1 era drammaticamente sovraregolati dopo sfida batterica con Edwardsiella ictaluri, mentre era downregulated in pesce gatto blu, una specie resistente al ictaluri E.³³. RBL svolge un ruolo importante nell’infezione iniziale con Flavobacterium columnare, l’agente eziologico della malattia columnaris, dove acuta e upregulation robusto è stato registrato in un ceppo di pesce gatto della manica columnaris-suscettibili rispetto ad un ceppo resistente columnaris³⁴.