Microinjection CRISPR/Cas9 प्रोटीन की चैनल कैटफ़िश, Ictalurus punctatus, जीन संपादन के लिए भ्रूण
Summary
CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग कर चैनल कैटफ़िश भ्रूण में जीन संपादन के लिए एक सरल और कुशल microinjection प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । इस प्रोटोकॉल में, गाइड RNAs और Cas9 प्रोटीन एक सेल भ्रूण की जर्दी में microinjected थे । इस प्रोटोकॉल बाहर दो चैनल कैटफ़िश प्रतिरक्षा से संबंधित जीन दस्तक द्वारा मांय किया गया है ।
Abstract
चैनल के पूरा जीनोम कैटफ़िश, Ictalurus punctatus, अनुक्रम किया गया है, चैनल कैटफ़िश जीन समारोह के अध्ययन के लिए अधिक से अधिक अवसरों के लिए अग्रणी । वीवो मेंइन जीन फंक्शन्स का अध्ययन करने के लिए जीन नॉकआउट का इस्तेमाल किया गया है । संकुल नियमित रूप से प्रतिस्थानीय लघु palindromic दोहराता/CRISPR जुड़े प्रोटीन 9 (CRISPR/Cas9) प्रणाली एक शक्तिशाली करने के लिए जीन समारोह में परिवर्तन जीनोमिक डीएनए दृश्यों को संपादित उपकरण का इस्तेमाल किया है । जबकि पारंपरिक दृष्टिकोण को microinjection के माध्यम से एकल सेल भ्रूण में CRISPR/Cas9 mRNA शुरू किया गया है, यह कैटफ़िश में एक धीमी और अक्षम प्रक्रिया हो सकती है । यहां, CRISPR/Cas9 प्रोटीन के साथ चैनल कैटफ़िश भ्रूण के microinjection के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । संक्षेप में, अंडे और शुक्राणु एकत्र किए गए और फिर कृत्रिम निषेचन किया । निषेचित अंडे एक पेट्री Holtfreter समाधान युक्त पकवान को हस्तांतरित किया गया । इंजेक्शन की मात्रा पर तुले थे और फिर RNAs/Cas9 लक्ष्यीकरण/interleukin 1 रिसेप्टर डोमेन-एडाप्टर अणु युक्त (TICAM 1) जीन और rhamnose बाध्यकारी लेक्टिन (RBL) जीन एक सेल भ्रूण की जर्दी में microinjected थे । जीन नॉकआउट indels डीएनए अनुक्रमण द्वारा की पुष्टि की गई के रूप में सफल रहा था । इन उत्परिवर्तनों की वजह से भविष्यवाणी की प्रोटीन अनुक्रम परिवर्तन frameshift और छोटे से समय से पहले बंद codons के कारण प्रोटीन शामिल थे ।
Introduction
Microinjection एक आम प्रयोगशाला ऐसी डीएनए, आरएनए, प्रोटीन के रूप में एक पदार्थ की एक छोटी राशि देने के लिए तकनीक का इस्तेमाल किया है, और एक ग्लास केशिका1के माध्यम से कोशिकाओं या भ्रूण में अंय अणुओं । Microinjection एक microinjector, micromanipulator, और एक खुर्दबीन2सहित विशेष उपकरण सेटअप का उपयोग किया जाता है । तकनीक शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है आनुवंशिक रूप से transgenics की पीढ़ी के माध्यम से कई जीवों को संशोधित करने के लिए, जीन नॉकआउट, और जीन थेरेपी, intracellular घटकों की गतिशीलता को समझने के उद्देश्य के साथ3,4 , 5.
चैनल कैटफ़िश (Ictalurus punctatus) संयुक्त राज्य अमेरिका में जलीय कृषि और मनोरंजन मछली पकड़ने की गतिविधियों में सबसे लोकप्रिय कैटफ़िश प्रजातियों में से एक है । चैनल कैटफ़िश में कार्यात्मक जीनोमिक्स अध्ययन करने के लिए एक बढ़ती जरूरत है, और चैनल कैटफ़िश के पूर्ण जीनोम के अनुक्रमण जीनोम संपादन उपकरण6,7में हाल ही में अग्रिमों की उपयोगिता को बढ़ाता है । समझ जीन समारोह केवल अनुसंधान कि कैटफ़िश पर आयोजित किया जा रहा है समृद्ध नहीं होगा, लेकिन यह भी अधिक प्रभावी आनुवंशिक सुधार कार्यक्रमों को कैटफ़िश उद्योग को बढ़ाने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । एक बार ब्याज की एक विशेषता के लिए महत्वपूर्ण जीन की पहचान की है, वे आनुवंशिक रूप से जीनोम संपादन के माध्यम से कैटफ़िश उत्पादन में सुधार के लिए लाभकारी alleles, इन alleles के लिए चयन उत्पंन, हानिकारक alleles को दबा इस्तेमाल किया जा सकता है, स्थानांतरित transgenesis के माध्यम से लाभकारी alleles, या इन विकल्पों में से कुछ संयोजन । एक मछली में विभिंन प्रजातियों में से अलग व्यावसायिक रूप से लाभप्रद लक्षण के लिए सबसे अच्छा जीन के संयोजन बहुत उत्पादकता और मछली उत्पादन आपरेशनों के लाभप्रदता8में सुधार होगा ।
जीन नॉकआउट vivo मेंजीन फंक्शन्स का अध्ययन करने का सीधा तरीका है । डीएनए के स्तर पर उत्परिवर्तनों भावी पीढ़ियों जो विभिंन पीढ़ियों में उनके प्रभाव के अध्ययन की सुविधा होगी द्वारा विरासत में मिला होगा । विभिंन जीनोम संपादन उपकरण जस्ता फिंगर nucleases (ZFNs), प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रभाव nucleases (TALENs), और नियमित रूप से प्रतिस्थानीय लघु palindromic दोहराता/CRISPR-जुड़े प्रोटीन 9 (CRISPR/Cas9 सहित विकसित किया गया है ) सिस्टम9,10,11,12.
CRISPR/Cas9 प्रणाली एक शक्तिशाली, कुशल उपकरण है कि आरएनए-निर्देशित साइट विशिष्ट डीएनए दरार5,13के माध्यम से मछली में जीन नॉकआउट सहित जीनोमिक डीएनए दृश्यों को संपादित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । प्रणाली एक गाइड आरएनए (gRNA) है, जो जीनोम और एक डीएनए endonuclease एंजाइम, Cas9 में लक्षित अनुक्रम निर्धारित करता है के होते हैं । CRISPR/Cas9 प्रणाली ZFNs और TALENs पर कई फायदों के साथ जीनोम में किसी भी अनुक्रम को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है: (1) कम लागत (2) आसान इंजीनियरिंग (3) लक्ष्य अनुक्रम के लिए गाइड आरएनए के अधिक विशिष्ट बंधन, और कम लक्ष्य उत्परिवर्तनों (4) एकाधिक दृश्यों को एक ही समय में अलग gRNA के साथ लक्षित किया जा सकता है (5) जीन में उच्च mutagenesis दर है कि TALENs द्वारा रूप नहीं दिया जा सकता है, और (6) में सुधार germline संचरण दर के लिए 6-गुना जब ZFNs और TALENs14की तुलना में, 15,16,17,18.
microinjection के लिए मुख्य वैकल्पिक विधि electroporation, जिसमें बिजली आवेगों भ्रूण या कोशिकाओं के लिए लागू कर रहे है झिल्ली पारगम्यता बढ़ाने के लिए और जैविक अणुओं19,20के ऊपर ले । medaka (Oryzias latipes), zebrafish (ढाणियो rerio), चिनूक सामन (Oncorhynchus tshawytscha), चैनल कैटफ़िश, सागर ब्रीम (Sparus स॓दबा) जैसे electroporation का उपयोग करते हुए कई ट्रांसजेनिक मछली उत्पन्न हुई और कॉमन कार्प (सायप्रिनस कार्पियो)21,22,23,24,25,26.
Electroporation जीन नॉकआउट के लिए प्लाज्मिड डीएनए, आरएनए, और Cas9 प्रोटीन देने के लिए इस्तेमाल किया गया है । स्तनधारी कोशिकाओं में, Cas9/gRNA प्लाज्मिड डीएनए, Cas9 mRNA/gRNA, और Cas9 प्रोटीन/gRNA परिसरों electroporation का उपयोग कर वितरित किया गया और mutagenesis सबसे Cas9 की स्थिति के लिए gRNA प्रोटीन/electroporation परिसरों का उपयोग कर रहे थे ।27परीक्षण किया गया । ascidian chordate में (Ciona intestinalis), TALENs व्यक्त constructs निषेचित अंडे में electroporated के लिए कई जीन28के नॉकआउट प्रेरित थे । ZFNs एक्सप्रेस प्लाज्मिड construction चैनल कैटफ़िश में luteinizing हार्मोन बाहर दस्तक करने के लिए electroporated थे29. हालांकि, एक बार सेल में पेश किया, प्लाज्मिड constructs आरएनए के लिए लिखित और कार्यात्मक प्रोटीन के लिए अनुवाद करने से पहले वे वांछित डीएनए अनुक्रम है, जो की संभावना mutagenesis के समय में देरी होगी लक्ष्य कर सकते है की आवश्यकता होगी आरएनए के microinjection की तुलना/ प्रोटीन. के रूप में एक भ्रूण विकसित कर रहा है, देरी mutagenesis इंजेक्शन संस्थापकों की पच्चीकारी बढ़ जाती है । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति microinjection के साथ संभव अभिव्यक्ति स्तर को प्राप्त करने के लिए संभावना नहीं है, mutagenesis दक्षता कम.
कोशिकाओं में जीनोम संपादन उपकरण शुरू करने के लिए एक साधन के रूप में, microinjection electroporation पर कई फायदे हैं । जीनोम संपादन अणुओं मज़बूती से कोशिकाओं या भ्रूण में microinjection30के माध्यम से शुरू किया जा सकता है । कम इंजेक्शन सामग्री की जरूरत है । यह सामग्री इंजेक्शन की मात्रा निर्धारित करने के लिए आसान है । संस्थापक मछली में कम मोज़ेक के साथ उच्च उत्परिवर्तन दर हासिल किया जा सकता है जो एफ1के लिए उत्परिवर्तनों के germline संचरण में सुधार होगा । कम संस्थापक मछली के लिए पहली पीढ़ी के उत्पादन, उच्च उत्परिवर्तन दर के कारण विश्लेषण किया जाना चाहिए । electroporation में, और अधिक संस्थापक मछली का विश्लेषण किया है जो लागत में वृद्धि होगी की जरूरत है । हालांकि, चैनल कैटफ़िश microinjected भ्रूण के अस्तित्व electroporated लोगों से कम है, हालांकि इस अधिक भ्रूण31इंजेक्शन से दूर किया जा सकता है,३२। चैनल कैटफ़िश में, जर्दी के अस्तित्व-microinjected भ्रूण 16 से ५५% से लेकर, निशाना बनाया जा रहा जीन पर निरभर है और gRNA/Cas9 प्रोटीन की खुराक३२।
कैटफ़िश भ्रूण की नियमित microinjection तकनीकी रूप से मांग और समय लगता है, तथापि, एक तेजी से और कुशल CRISPR/Cas9 प्रोटीन microinjection प्रोटोकॉल चैनल कैटफ़िश भ्रूण के लिए प्रस्तुत किया है । इस प्रोटोकॉल CRISPR/Cas9 प्रोटीन समाधान के बाद से कम समय और विशेषज्ञता की आवश्यकता है एक सेल भ्रूण की जर्दी में इंजेक्शन है । निषेचित अंडे के सैकड़ों 1 घंटे में इंजेक्शन किया जा सकता है (लगभग समय पहले कोशिका विभाजन के लिए आवश्यक हो) । प्रोटोकॉल को मांय करने के लिए, दो रोग संवेदनशीलता से संबंधित जीन चैनल कैटफ़िश, टोल/interleukin 1 रिसेप्टर डोमेन एडाप्टर अणु (TICAM1) जीन और rhamnose बाध्यकारी लेक्टिन (RBL) जीन युक्त में खटखटाया गया । TICAM 1 संकेत मार्ग टोल की तरह रिसेप्टर (TLR) 3 द्वारा शुरू में शामिल है । चैनल कैटफ़िश में, TICAM 1 नाटकीय रूप से Edwardsiella ictaluriके साथ बैक्टीरिया की चुनौती के बाद विनियमित था, जबकि यह नीले downregulated में कैटफ़िश था, एक प्रजातियों के लिए प्रतिरोधी ई. ictaluri३३। RBL के साथ जल्दी संक्रमण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है Flavobacterium columnare, columnaris रोग के प्रेरणा का एजेंट, जहां तीव्र और मजबूत विनियमन एक columnaris-अतिसंवेदनशील चैनल कैटफ़िश तनाव में दर्ज की गई एक की तुलना में columnaris प्रतिरोधी तनाव३४।
Protocol
Representative Results
Discussion
चैनल कैटफ़िश भ्रूण की microinjection के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल जीन नॉकआउट प्राप्त करने के लिए प्रस्तुत किया गया था । CRISPR/Cas9 के इंजेक्शन की जर्दी में प्रोटीन बहुत आसान है, समय बचाता है, और व्यापक प्रशिक्षण की आवश?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह शोध USDA-निफा ने रोजर शंकु को 2015-67015-23488 पुरस्कार से वित्त पोषित किया गया । लेखक डॉ रोनाल्ड Phelps चिंता वीडियो में शेयर चयन मानदंड के विवरण के लिए धंयवाद । अहमद Elaswad और करीम खलील अपने पीएच. डी. अनुसंधान के वित्तपोषण के लिए वाशिंगटन डीसी में मिस्र के सांस्कृतिक और शैक्षिक ब्यूरो का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| Reproboost implant | Center of Marine Biotechnology | Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females | |
| TRICAINE-S | Western Chemical. Inc. | For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5%, sterile filtered |
| Stereo microscope | Olympus | 213709 | For visualizing the eggs during microinjection |
| Microinjector | ASI-Applied Scientific Instrumentation | Model MPPI-3 | For the delivery of the injection material into the embryos |
| Micromanipulator | ASI-Applied Scientific Instrumentation | Model MM33 | For holding and controlling the movement of the injection needle. |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956.003 | For loading injection solution into microinjection needles. |
| Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 720 | For pulling microinjection needles |
| Cas9 protein | PNA Bio Inc. | CP01 | Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes. |
| Expand High FidelityPLUS PCR System | Roche Diagnostics, USA | For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation | |
| Borosilicate glass capillaries | Fisher Scientific | 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles. | |
| Petri dish | VWR | 25384-302 | For holding the embryos during the microinjection. |
| Crisco | The J.M. Smucker Company | Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. | |
| Holtfreter`s solution | Home Made | 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. | |
| Doxycycline hyclate USP (monohydrate) | Letco Medical | 690904 | Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections. |
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