JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genética

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

Published: January 20, 2018
doi:
10.3791/56275
, , , , , , ,
1School of Fisheries, Aquaculture and Aquatic Sciences,Auburn University, 2Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine,Suez Canal University, 3Anatomy and Embryology Department, Faculty of Veterinary Medicine,Cairo University, 4Department of Molecular Physiology and Biophysics,Vanderbilt University, 5Life Science Institute,University of Michigan

Summary

פרוטוקול microinjection פשוטה ויעילה לעריכה ג’ין ב ערוץ שפמנון עוברי באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 מוצג. ב פרוטוקול זה, מדריך RNAs, חלבון Cas9 היו microinjected לתוך החלמון של תא אחד העוברים. פרוטוקול זה אומתה על ידי לדפוק שני גנים הקשורים החיסון ערוץ שפמנון.

Abstract

הגנום המלא של השפמנון ערוץ, Ictalurus punctatus, יש כבר וסודרו, שמוביל הזדמנויות ללמוד ערוץ שפמנון ג’ין פונקציה. נוקאאוט גנטי שימש ללמוד פונקציות אלה ג’ין בתוך vivo. באופן קבוע באשכולות interspaced חלבון קצר palindromic חזרה/CRISPR הקשורים 9 (CRISPR/Cas9) המערכת היא כלי רב עוצמה המשמש לעריכת רצפי דנ א גנומי לשנות תפקוד הגן. בזמן הגישה המסורתית הייתה להציג CRISPR/Cas9 mRNA לתוך תא בודד העוברים דרך microinjection, זה יכול להיות תהליך איטי ולא יעיל של שפמנון. . הנה, מתואר פרוטוקול מפורט עבור microinjection של העוברים ערוץ שפמנון. עם חלבון CRISPR/Cas9. בקצרה, ביצים, הזרע היו הפריה שנאספו, ואז מלאכותיים שבוצעה. הביצים הועברו צלחת פטרי המכילות הפתרון של Holtfreter. נפח הזרקה היה מכויל, ואז מדריך RNAs/Cas9 מיקוד אגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (טיקם 1) הגן לקולטן וג’ין לקטין (RBL) rhamnose האיגוד היו microinjected לתוך החלמון של תא אחד העוברים. נוקאאוט גנטי היה מוצלח כמו indels שאושרו על-ידי רצפי DNA. התיקונים רצף החלבון החזוי עקב מוטציות אלה כלולים frameshift, נחתך החלבון עקב עצירה מוקדמת codons.

Introduction

Microinjection היא טכניקה מעבדה נפוץ נהגה לספק כמות קטנה של חומר כמו DNA, RNA, חלבון ו מקרומולקולות אחרות לתוך תאים או עוברי דרך נימי זכוכית1. Microinjection מתבצעת באמצעות ציוד מיוחד ההתקנה כולל של microinjector, micromanipulator ו- מיקרוסקופ2. הטכניקה נעשה שימוש על ידי חוקרים כדי שינוי גנטי אורגניזמים רבים דרך הדור של transgenics, ג’ין הסתרה ולאחר טיפול גנטי, במטרה להבין את הדינמיקה של רכיבים תאיים3,4 , 5.

השפמנון ערוץ (Ictalurus punctatus) הוא המין שפמנון הפופולרי ביותר בחקלאות מים ופעילויות פנאי דיג בארצות הברית. יש צורך להגדיל ללמוד גנומיקה תפקודית ב ערוץ שפמנון ומגביר את רצף הגנום המלא של ערוץ שפמנון השירות של התפתחויות אחרונות הגנום-6,כלים-עריכה-7. להבנת תפקוד הגן לא רק להעשיר את המחקר מתנהל על שפמנון, אך גם להוביל תוכניות שיפור גנטי יעיל יותר כדי לשפר את תעשיית שפמנון. ברגע גנים קריטי עבור תכונה נתונה עניין מזוהים, הם יכולים לשמש לשיפור גנטית שפמנון ייצור באמצעות הגנום עריכה כדי להפיק תועלת אללים, הבחירה עבור אלה אללים, דיכוי של אללים מזיקה, העברת אללים מועיל דרך transgenesis, או שילוב של אפשרויות אלה. שילוב של הגנים הטובים ביותר עבור תכונות מועילות מסחרית שונים מ מינים שונים של דגים אחד לשפר במידה רבה פריון ורווחיות של דגים הפקה פעילות8.

נוקאאוט גנטי היא שיטה ישירה ללמוד ג’ין פונקציות בתוך vivo. מוטציות סמני דנ א תעבור בירושה לדורות אשר יקל את חקר ההשפעות שלהם בדורות שונים. כלי עריכה הגנום שונים יש כבר מפותחת כולל אבץ אצבע nucleases (ZFNs), תמלול אפקטור activator דמוי nucleases (TALENs), מקובצים באופן קבוע interspaced קצר palindromic חזרה/CRISPR-הקשורים חלבון 9 (CRISPR/Cas9 ) מערכת9,10,11,12.

מערכת CRISPR/Cas9 הוא כלי רב עוצמה, יעיל ששימש לעריכת רצפי דנ א גנומי כולל נוקאאוט גנטי בדגים עד מונחה RNA ספציפי לאתר ה-DNA המחשוף5,13. המערכת מורכבת RNA מדריך (gRNA), אשר קובע את רצף יישוב הגנום, אנזים endonuclease דנ א, Cas9. ניתן לעצב את מערכת CRISPR/Cas9 היעד כל רצף הגנום עם מספר יתרונות על ZFNs ועל TALENs: נמוך (1) עלות (2) קל הנדסה קשירה (3) יותר ספציפי של מדריך RNA רצף המטרה, צמצמה את המטרה מוטציות (4) ניתן לפלח רצפים מרובים עם gRNA שונים באותו זמן (5) מוטגנזה מכוונת גבוה קצב גנים יכול לא להיות מוטציה על ידי TALENs, (6) קצב השידור germline משופרת של מוטציות עבור עד 6-fold בהשוואה ZFNs, TALENs14, 15,16,17,18.

שיטת אלטרנטיבית הראשי עבור microinjection היא אלקטרופורציה, שבו מוחלות דחפים חשמליים העוברים או לתאים להגברת חדירות הממברנה ואת ספיגת של מולקולות ביולוגיות19,20. מספר דגים הטרנסגניים נוצרו באמצעות אלקטרופורציה כגון ערוץ שפמנון, שישן (Sparus sarba), סלמון צ’ינוק (Oncorhynchus tshawytscha), דג זברה (רזבורה rerio), medaka (Oryzias latipes), נפוץ קרפיון (קרפיון carpio)21,22,23,24,25,26.

אלקטרופורציה שימש כדי לספק חלבון ה-DNA, RNA ו- Cas9 פלסמיד עבור נוקאאוט גנטי. בתרבית של תאים, Cas9/gRNA פלסמיד ה-DNA, Cas9 mRNA/gRNA, Cas9 חלבון/gRNA מתחמי נשלחו באמצעות אלקטרופורציה, תעריפי מוטגנזה מכוונת הגבוהה ביותר באמצעות קומפלקסים של חלבונים/gRNA Cas9 עבור אלקטרופורציה רוב התנאים נבדקו27. Ascidian מיתרניים (Ciona intestinalis), היו TALENs המבטאת מבנים electroporated לתוך הביצים לזירוז נוקאאוט של גנים מרובים28. ZFNs לבטא פלסמיד בונה היו electroporated לדפוק את הורמון מחלמן שפמנון ערוץ29. עם זאת, ברגע הציג לתוך התא, בונה פלסמיד יהיה עליך להיות עיבד את ה-RNA, תרגם חלבונים פונקציונליים לפני בהם ניתן לסמן את רצף ה-DNA הרצוי, אשר סביר להניח יעכב את הזמן של מוטגנזה מכוונת לעומת microinjection של RNA / חלבון. כאשר העובר מתפתח, מוטגנזה מכוונת מושהית מגביר את פסיפס של מייסדי מוזרק. בנוסף, ביטוי הטרנסגניים סביר להשגת רמת ביטוי אפשרי עם microinjection, מוריד את היעילות מוטגנזה מכוונת.

כאמצעי ידביקו כלי עריכה הגנום בתאים, microinjection יש כמה יתרונות על פני אלקטרופורציה. הגנום עריכה מולקולות שיוכל אמינה להיכנס לתוך התאים או עוברי דרך microinjection30. חומר ההזרקה פחות נחוץ. . זה קל לקבוע את הכמויות של חומר מוזרק… מוטציה גבוהה המחירים עם פסיפס נמוך ב הדג מייסד יכולה להיות מושגת אשר תשפר germline שידור של מוטציות F1. דגים מייסד פחות צריך להיות מנותח כדי לייצר את הדור הראשון, עקב קצב מוטציה גבוהה יותר. אלקטרופורציה, עוד דגים מייסד צריך להיות מנותח אשר יגדיל עלויות. עם זאת, ההישרדות של ערוץ שפמנון microinjected עוברי הוא נמוך יותר electroporated אלה, אבל זה ניתן להתגבר על ידי הזרקת העוברים עוד31,32. ערוץ שפמנון, ההישרדות של microinjected-חלמון עוברי נע בין 16 ל- 55%, בהתאם הגנים מהווים מטרה, את המינון של חלבון gRNA/Cas932.

Microinjection קבוע של שפמנון העוברים הוא תובעני מבחינה טכנית, זמן רב, עם זאת, פרוטוקול microinjection חלבון CRISPR/Cas9 מהיר ויעיל מוצג עבור ערוץ שפמנון עוברי. פרוטוקול זה דורש פחות זמן ומומחיות מאז הפתרון חלבון CRISPR/Cas9 מוזרק לתוך החלמון של עוברי לתא אחד. יכול להיות מוזרק מאות הביצים ב h 1 (כ הזמן הדרוש עבור ליגה תא להתרחש). כדי לאמת את הפרוטוקול, שני גנים למחלות הקשורות הרגישות קיבלת מכה שפמנון ערוץ, את האגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (TICAM1) הגן לקולטן, הגן לקטין (RBL) מחייב rhamnose. 1 טיקם מעורב מסלול איתות שיזם קולטן דמוי-אגרה (TLR) 3. ערוץ שפמנון, טיקם 1 היה דרמטי upregulated בעקבות האתגר חיידקי עם Edwardsiella ictaluri, עוד הייתה downregulated ב כחול שפמנון, עמיד ictaluri ה33מינים. RBL ממלא תפקיד חשוב ב זיהום מוקדם עם Flavobacterium columnare, סוכן סיבתי של מחלת columnaris, שבו חריפה, קולטנים upregulation חזקים נרשמה זן שפמנון ערוץ columnaris, רגישים בהשוואה זן עמיד columnaris34.

Protocol

ניסוי זה נערך היחידה לחקר הגנטיקה של דגים, אי מעטפת וו הדיג מרכז מחקר, אוניברסיטת אובורן, AL. כל הפרוטוקולים ניסיוני השתמשו בניסוי זה אושרו על ידי אובורן אוניברסיטת אכפת חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (AU-IACUC) לפני הניסוי היה יזם. רשימה של ציוד ואספקה השתמשו בניסוי זה ניתן למצוא בטבלת חומרים. להל…

Representative Results

כדי להדגים את היעילות של פרוטוקול microinjection, gRNAs שנועדו למקד את השפמנון ערוץ אגרה/אינטרלוקין 1 המכיל קבוצת מחשבים מתאם מולקולה (TICAM1) הגן לקולטן וג’ין rhamnose איגוד לקטין (RBL) היו microinjected. טיקם 1רצפי DNA של וקטורים של מושבות בודדות ממוצרי?…

Discussion

הוצג פרוטוקול מפורט עבור microinjection של ערוץ שפמנון העוברים על מנת להשיג נוקאאוט גנטי. הזרקה של חלבון CRISPR/Cas9 החלמון היא הרבה יותר פשוטה, חוסך זמן, אינה דורשת הכשרה נרחבת בהשוואה microinjecting של blastodisc של העובר תא אחד, אשר הוא הטכניקה נפוצה ברוב העברה גנטית ועריכה ג’ין עם דגים 30 , <sup c…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי משרד החקלאות-NIFA פרס 2015-67015-23488 רוג’ר חרוט. המחברים מודים ד ר רונלד פלפס על התיאור של קריטריוני הבחירה מניות שבוחרים וידאו. אחמד Elaswad, כרים חליל רוצה להודות את התרבות המצרית, הלשכה חינוכיים בוושינגטון למימון המחקר Ph.d. שלהם.

Materials

Reproboost implant Center of Marine Biotechnology Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females
TRICAINE-S Western Chemical. Inc. For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. 
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 0.5%, sterile filtered
Stereo microscope Olympus 213709 For visualizing the eggs during microinjection
Microinjector ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MPPI-3 For the delivery of the injection material into the embryos
Micromanipulator ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MM33  For holding and controlling the movement of the injection needle. 
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956.003 For loading injection solution into microinjection needles.
Vertical needle puller David Kopf Instruments Model 720 For pulling microinjection needles
Cas9 protein PNA Bio Inc.  CP01 Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR System  Roche Diagnostics, USA For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation
Borosilicate glass capillaries Fisher Scientific 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.
Petri dish VWR 25384-302 For holding the embryos during the microinjection.
Crisco The J.M. Smucker Company Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. 
Holtfreter`s solution Home Made 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. 
Doxycycline hyclate USP (monohydrate) Letco Medical 690904 Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
  2. Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. . Components of a microinjection system. , 935-939 (2011).
  3. Du, S. J., et al. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an "all fish" chimeric growth hormone gene construct. Nat. Biotechnol. 10 (2), 176-181 (1992).
  4. Davis, B., Brown, D., Prokopishyn, N., Yannariello-Brown, J. Micro-injection-mediated hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (4), 412-419 (2000).
  5. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  6. Liu, Z., et al. The channel catfish genome sequence provides insights into the evolution of scale formation in teleosts. Nat. Commun. 7, (2016).
  7. Abdelrahman, H., et al. Aquaculture genomics, genetics and breeding in the United States: current status, challenges, and priorities for future research. BMC Genomics. 18 (1), 191 (2017).
  8. Dunham, R. A. . Aquaculture and Fisheries Biotechnology : Genetic Approaches. , (2011).
  9. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  10. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  11. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 41 (20), 9584-9592 (2013).
  16. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  17. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  18. Li, M., Zhao, L., Page-McCaw, P. S., Chen, W. Zebrafish genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Trends Genet. 32 (12), 815-827 (2016).
  19. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841 (1982).
  20. Powers, D. A., et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 301-308 (1991).
  21. Inoue, K., et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differ. Dev. 29 (2), 123-128 (1990).
  22. Buono, R., Linser, P. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 271-275 (1991).
  23. Sin, F., et al. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture. 117 (1-2), 57-69 (1993).
  24. Dunham, R. A., et al. Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus possessing cecropin genes. Mar. Biotechnol. 4 (3), 338-344 (2002).
  25. Lu, J. K., Fu, B. H., Wu, J. L., Chen, T. T. Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods. Mar. Biotechnol. 4 (3), 328-337 (2002).
  26. Cheng, Q., et al. Interaction of diet and the masou salmon Δ5-desaturase transgene on Δ6-desaturase and stearoyl-CoA desaturase gene expression and N-3 fatty acid level in common carp (Cyprinus carpio). Transgenic Res. 23 (5), 729-742 (2014).
  27. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 208, 44-53 (2015).
  28. Treen, N., et al. Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts by TALEN electroporation provide new approaches to investigating gene function in Ciona. Development. 141 (2), 481-487 (2014).
  29. Qin, Z., et al. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Mar. Biotechnol. 18 (2), 255-263 (2016).
  30. Qin, Z. . Gene editing of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and gonadotropin-releasing hormone genes to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 technologies. , (2015).
  31. Dunham, R. A., Winn, R. N., Pinkert, C. A. . Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. , 308-336 (2014).
  32. Elaswad, A. . Genetic technologies for disease resistance research and enhancement in catfish. , (2016).
  33. Baoprasertkul, P., Peatman, E., Somridhivej, B., Liu, Z. Toll-like receptor 3 and TICAM genes in catfish: species-specific expression profiles following infection with Edwardsiella ictaluri. Immunogenetics. 58 (10), 817-830 (2006).
  34. Thongda, W., Li, C., Luo, Y., Beck, B. H., Peatman, E. L-rhamnose-binding lectins (RBLs) in channel catfish, Ictalurus punctatus: Characterization and expression profiling in mucosal tissues. Dev. Comp. Immunol. 44 (2), 320-331 (2014).
  35. Phelps, R. P., et al. Effects of temperature on the induced spawning of channel catfish and the production of channel× blue catfish hybrid fry. Aquaculture. 273 (1), 80-86 (2007).
  36. Poole, W., Dillane, M. Estimation of sperm concentration of wild and reconditioned brown trout, Salmo trutta L. Aquacult. Res. 29 (6), 439-445 (1998).
  37. Billard, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reprod. Nutr. Dev. 26 (4), 877-920 (1986).
  38. Coyle, S. D., Durborow, R. M., Tidwell, J. H. . Anesthetics in aquaculture. , (2004).
  39. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nat. Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  40. Armstrong, J., Duhon, S., Malacinski, G. . Developmental Biology of the Axolotl. , 220-227 (1989).
  41. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J. Vis. Exp. (46), (2010).
  42. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055 (2016).
  43. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  44. Silverstein, J. T., Small, B. C., Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. . Biology and Culture of Channel Catfish. 34, 69-94 (2004).
  45. Su, B., et al. Relative effectiveness of carp pituitary extract, luteininzing hormone releasing hormone analog (LHRHa) injections and LHRHa implants for producing hybrid catfish fry. Aquaculture. 372, 133-136 (2013).
  46. Aluru, N., et al. Targeted mutagenesis of aryl hydrocarbon receptor 2a and 2b genes in Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus). Aquat. Toxicol. 158, 192-201 (2015).
  47. Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
  48. Edvardsen, R. B., Leininger, S., Kleppe, L., Skaftnesmo, K. O., Wargelius, A. Targeted mutagenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) using the CRISPR/Cas9 system induces complete knockout individuals in the F0 generation. PLoS ONE. 9 (9), e108622 (2014).
  49. Li, M., et al. Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9. Genética. 197 (2), 591-599 (2014).
  50. Zhong, Z., et al. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp. Sci. Rep. 6, (2016).
  51. Chakrapani, V., et al. Establishing targeted carp TLR22 gene disruption via homologous recombination using CRISPR/Cas9. Dev. Comp. Immunol. 61, 242-247 (2016).
  52. Lim, J., Ghadessy, F. J., Yong, E. A novel splice site mutation in the androgen receptor gene results in exon skipping and a non-functional truncated protein. Mol. Cell. Endocrinol. 131 (2), 205-210 (1997).
  53. Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F. D., Bork, P., Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO Journal. 22 (15), 3960-3970 (2003).
  54. Talerico, M., Berget, S. M. Effect of 5’splice site mutations on splicing of the preceding intron. Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6299-6305 (1990).

Tags

Keywords: CRISPR/Cas9MicroinjectionChannel CatfishIctalurus PunctatusGene EditingTICAM1RBLBroodstock SelectionSpawningLHRHAHormone InjectionEmbryoProtocolFunctional Genomics
check_url/pt/56275?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D., Page-McCaw, P., Chen, W., Michel, M., Cone, R., Dunham, R. Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing. J. Vis. Exp. (131), e56275, doi:10.3791/56275 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image