Mikroinjektion ist eine verbreitete Labortechnik verwendet, um eine kleine Menge einer Substanz wie DNA, RNA, Proteine und andere Makromoleküle in Zellen oder Embryos durch eine Glas-Kapillare-¹liefern. Mikroinjektion wird mit Sonderausstattung Einrichtung einschließlich einer Microinjector, Mikromanipulator und Mikroskop²durchgeführt. Die Technik wurde von den Forschern verwendet, um genetisch zu verändern viele Organismen durch die Generierung von gentechnisch veränderten Pflanzen, gen-Knockouts und Gentherapie, mit dem Ziel, Verständnis der Dynamik von intrazellulären Komponenten^{3,4 , 5}.

Der Kanal Wels (Ictalurus Punctatus) ist die beliebteste Wels-Arten in der Aquakultur und Freizeitfischerei Aktivitäten in den Vereinigten Staaten. Gibt es ein zunehmender Bedarf FunktionsGenomics in Channel Catfish zu studieren, und Sequenzierung des kompletten Genoms Channel Catfish erhöht den Nutzen der jüngsten Fortschritte in der Genome editing Tools^6,7. Genfunktion Verständnis würde nicht nur bereichern die Forschung, die auf Wels durchgeführt wird, sondern könnte auch zu effektiver genetischen Verbesserungsprogrammen, Wels-Industrie zu verbessern. Sobald wichtige Gene für ein bestimmtes Merkmal von Interesse identifiziert sind, können sie verwendet werden, genetisch Wels Produktion durch Erbgut Bearbeitung um vorteilhafte Allele generieren Auswahl für diese Allele, unterdrücken die schädlichen Allele, Übertragung zu verbessern die vorteilhafte Allele durch Transgenese oder eine Kombination dieser Optionen. Kombiniert die besten Gene für verschiedene wirtschaftlich vorteilhaften Eigenschaften von verschiedenen Arten in einen Fisch würde erheblich verbessern Produktivität und Rentabilität von Fisch Produktion Betrieb⁸.

Gen Knockout ist eine direkte Methode, gen Funktionen in Vivozu studieren. Mutationen in der DNA-Ebene werden von zukünftigen Generationen vererbt werden, die ihre Auswirkungen in verschiedenen Generationen erleichtern wird. Unterschiedliche Genom-Bearbeitungs-Tools wurden entwickelten einschließlich Zink Finger Nukleasen (ZFN), Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nukleasen (TALENs) und gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen/CRISPR-assoziierten Protein 9 (CRISPR/Cas9 ) System^9,10,11,12.

Das CRISPR/Cas9-System ist eine leistungsstarke, effiziente Werkzeug, das verwendet wurde, um die genomische DNA-Sequenzen auch gen Knockout in Fische durch RNA-geführte Site-spezifische DNA-Spaltung^5,13bearbeiten. Das System besteht aus einen Leitfaden RNA (gRNA), die die gezielte Reihenfolge in das Genom und eine DNA-Endonuklease Enzym, Cas9 bestimmt. Das CRISPR/Cas9-System kann in beliebiger Reihenfolge in das Genom mehrere Vorteile gegenüber ZFN und TALENs Ziel gestaltet werden: (1) niedriger Kosten (2) einfacher Technik (3) mehr spezifische Bindung der RNA Anleitungenzu Zielsequenz, und reduziert Ziel Mutationen (4) mehrere Sequenzen können mit verschiedenen gRNA mit der gleichen Zeit (5) hohe Mutagenese Rate in Gene gezielt eingesetzt werden, die nicht von TALENs und (6) verbesserte Keimbahn-Übertragungsrate von Mutationen für bis zu 6-Fach mutiert sein könnte im Vergleich zu ZFN und TALENs^{14, 15,16,17,18}.

Die wichtigste alternative Methode für die Mikroinjektion ist Elektroporation, in denen elektrische Impulse auf Embryonen oder Zellen Membranpermeabilität und die Aufnahme von biologischen Molekülen^19,20erhöhen angewendet werden. Mehrere transgene Fische wurden mit Elektroporation wie Medaka (Oryzias Latipes), Zebrafisch (Danio Rerio), Königslachs (Oncorhynchus Tshawytscha), Channel Catfish, Goldbrasse (Sparus Mitgleid) erzeugt und gemeinsamen Karpfen (Cyprinus Carpio)^{21,22,23,24,25,26}.

Elektroporation wurde zur Plasmid DNA, RNA und Cas9 Protein für gen Knockout zu liefern. In Säugetierzellen, Cas9/gRNA Plasmid DNA, Cas9 mRNA/gRNA und Cas9 Protein/gRNA komplexe wurden geliefert mit Elektroporation und Mutagenese Preise waren mit Cas9 Protein/gRNA komplexe für die meisten Elektroporation Bedingungen getestet²⁷am höchsten. In der Ascidian Chordate (Ciona Intestinalis) waren TALENs Konstrukte auszudrücken elektroporiert in befruchteten Eizellen, Ko von mehreren Genen²⁸zu induzieren. ZFN auszudrücken Plasmid Konstrukte wurden elektroporiert, knock out luteinisierendes Hormon im Channel Catfish²⁹. Einmal in die Zelle eingeführt, Plasmid Konstrukte werden müssen jedoch an RNA transkribiert und nach Funktionsproteine übersetzt, bevor sie die gewünschte DNA-Sequenz, die wahrscheinlich die Zeit der Mutagenese im Vergleich zur Mikroinjektion RNA verzögern würde ausrichten können / Protein. Ein Embryo entwickelt, mit zunehmender verzögerte Mutagenese Mosaikbildung der injizierten Gründer. Darüber hinaus dürfte die transgene Ausdruck den Ausdruck möglich mit Mikroinjektion, Senkung der Mutagenese-Effizienz zu erreichen.

Als Mittel für die Einführung von Genom-editing-Tools in Zellen hat Mikroinjektion mehrere Vorteile gegenüber Elektroporation. Genom Bearbeitung Moleküle kann zuverlässig in Zellen oder Embryos durch Mikroinjektion³⁰eingeführt werden. Weniger Injektionsmaterial ist erforderlich. Es ist leicht zu bestimmen, die Mengen an Material gespritzt. Höheren Mutation werden Tarife mit niedrigen Mosaikbildung im Gründer Fisch erreicht die Keimbahn Übertragung der Mutationen, F₁verbessern würde. Weniger Gründer Fische müssen analysiert werden, um die erste Generation, durch die höhere Mutationsrate zu produzieren. In Elektroporation müssen mehr Gründer Fische analysiert werden die Kosten steigen. Das Überleben der Channel Catfish mikroinjiziert Embryonen ist jedoch niedriger als elektroporiert diejenigen, obwohl dies durch die Injektion mehr Embryonen^31,32überwunden werden kann. Im Channel Catfish, Überleben von Eigelb mikroinjiziert Embryonen reichte von 16 bis 55 %, abhängig von den Genen angestrebt und die Dosierung von gRNA/Cas9 Protein³².

Regelmäßige Mikroinjektion von Wels Embryonen ist technisch anspruchsvoll und zeitraubend, jedoch eine schnelle und effiziente CRISPR/Cas9 Protein Mikroinjektion Protokoll ist für Channel Catfish Embryonen vorgestellt. Dieses Protokoll erfordert weniger Zeit und Know-how, da die Proteinlösung CRISPR/Cas9 in das Eigelb von einer Zelle Embryonen injiziert wird. Hunderte von befruchteten Eizellen können in 1 h (etwa den Zeitaufwand für die erste Zellteilung auftreten) injiziert werden. Um das Protokoll zu überprüfen, wurden zwei Krankheit Anfälligkeit-Genen in Channel Catfish, die Maut/Interleukin-1 Rezeptor Domäne-haltigen Adapter Molekül (TICAM1) gen und Rhamnose bindende Lektin (RBL) gen klopfte. TICAM 1 engagiert sich in den Signalweg initiiert von Toll-Like-Rezeptor (TLR) 3. Im Channel Catfish war TICAM 1 dramatisch hochreguliert nach bakteriellen Foulspiel mit Edwardsiella Ictaluri, während es herunterreguliert in blau Wels, eine Spezies resistent gegen E. Ictaluri³³war. RBL spielt eine wichtige Rolle in frühe Infektion mit Flavobacterium Columnare, der Erreger der Columnaris Krankheit, wo akute und robuste Hochregulation verzeichnete eine Columnaris-anfälligen Channel Catfish-Belastung im Vergleich zu einem Columnaris-resistenten Stamm³⁴.