Microinjection est une technique courante de laboratoire utilisée pour livrer une petite quantité d’une substance telle que l’ADN, ARN, protéines et autres macromolécules dans des cellules ou des embryons dans un capillaire de verre¹. Microinjection est effectuée à l’aide de la configuration d’équipements spéciaux dont un microinjector micromanipulateur et un microscope². La technique a été utilisée par les chercheurs de modifier génétiquement les nombreux organismes grâce à la génération de transgénèse, débouchures de gènes et thérapie génique, dans le but de comprendre la dynamique des composants intracellulaires^{3,4 , 5}.

La barbue de rivière (Ictalurus punctatus) est l’espèce de poisson-chat plus populaires dans l’aquaculture et les activités de pêche récréative aux États-Unis. Il y a un besoin croissant pour l’étude génomique fonctionnelle chez la barbue et le séquençage du génome complet du barbue améliore l’utilité des progrès récents en génomique édition outils^6,7. Comprendre la fonction du gène n’enrichirait pas seulement la recherche qui est actuellement menée sur le poisson-chat, mais pourrait également conduire à des programmes d’amélioration génétique plus efficaces pour améliorer l’industrie du poisson-chat. Une fois que les gènes critiques pour un trait donné d’intérêt sont identifiés, ils peuvent être utilisés pour améliorer génétiquement production poisson-chat par l’édition de génome pour générer des allèles bénéfiques, sélection pour ces allèles, supprimant les allèles préjudiciables, transfert les allèles avantageux grâce à la transgénèse, ou une combinaison de ces options. Combinant les meilleurs gènes pour différents traits commercialement bénéfiques provenant de différentes espèces dans un poisson améliorerait considérablement la productivité et la rentabilité de poisson production opérations⁸.

Knock-out du gène est une méthode directe pour étudier les fonctions de gènes in vivo. Mutations au niveau de l’ADN seront héritées par les générations futures qui faciliteront l’étude de leurs effets dans les différentes générations. Outils d’édition différents génomes ont été développés notamment zinc finger nucleases (ZFNs), transcription nucléases activator comme effecteur (TAPS) et groupés régulièrement dois‑je court palindrome répétitions/CRISPR-protéine associée à la 9 (CRISPR/Cas9 ) système^9,10,11,12.

Le système CRISPR/Cas9 est un outil puissant et efficace qui a été utilisé pour modifier des séquences d’ADN génomique y compris knock-out du gène chez les poissons à guidage RNA DNA in situ clivage^5,13. Le système est constitué d’un ARN guide (gRNA), qui détermine la séquence ciblée dans le génome et une enzyme d’endonucléase ADN, Cas9. Le système CRISPR/Cas9 peut être conçu pour cibler n’importe quelle séquence du génome avec plusieurs avantages par rapport aux ZFNs et TALENs : (1) plus bas coût d’ingénierie (2) plus facile fixation (3) plus spécifique du guide RNA de la séquence cible et réduit les mutations hors cible (4) plusieurs séquences peuvent être ciblées avec différent gRNA à la même vitesse de mutagenèse haute heure (5) dans les gènes qui ne pourrait pas être muté par TALENs et (6) taux de transmission meilleure lignée germinale des mutations pour jusqu’à 6 fois par rapport aux ZFNs et TALENs^{14, 15,16,17,18}.

L’autre principale méthode de microinjection est électroporation, dans lequel les impulsions électriques sont appliquées à des embryons ou des cellules pour augmenter la perméabilité de la membrane et l’absorption des molécules biologiques^19,20. Plusieurs poissons transgéniques ont été générés en utilisant l’électroporation comme medaka (Oryzias latipes), poisson zèbre (Danio rerio), le saumon chinook (Oncorhynchus tshawytscha), barbue, la dorade (Sparus sarba), et commune la carpe (Cyprinus carpio)^{21,22,23,24,25,26}.

Électroporation a été utilisée pour fournir des protéines ADN, d’ARN et Cas9 de plasmide pour knock-out du gène. Dans les cellules de mammifères, Cas9/gRNA plasmid DNA, Cas9 ARNm/gRNA et des complexes de protéine/gRNA Cas9 ont été livrés à l’aide d’électroporation et les taux de mutagenèse étaient plus élevés utilisant des complexes de protéine/gRNA Cas9 pour la plupart électroporation conditions testées²⁷. Les chordés ascidies (Ciona intestinalis), TALENs exprimant les constructions étaient électroporation dans des oeufs fécondés pour induire la knockout de multiples gènes²⁸. ZFNs exprimant le plasmide constructions étaient électroporation pour assommer l’hormone lutéinisante dans barbue²⁹. Cependant, une fois introduit dans la cellule, des constructions de plasmide devra être transcrit à l’ARN et traduit en protéines fonctionnelles avant qu’ils peuvent cibler la séquence d’ADN désirée, ce qui retarderait probablement le temps de la mutagénèse par rapport à la microinjection d’ARN / protéine. Telle qu’un embryon se développe, mutagenèse retard augmente le mosaïcisme des fondateurs injectées. En outre, l’expression transgénique est peu susceptible d’atteindre le niveau d’expression possible avec microinjection, abaissant l’efficacité de la mutagénèse.

Comme un moyen pour introduire des outils d’édition du génome dans les cellules, microinjection présente plusieurs avantages sur électroporation. Génome, édition de molécules peut être fiable introduit dans des cellules ou des embryons par microinjection³⁰. Moins de matériel injection est nécessaire. Il est facile de déterminer les quantités de matériau injecté. Mutation plus élevée avec faible mosaïcisme chez les poissons du fondateur, les taux peuvent être réalisés qui améliorerait la transmission de la lignée germinale des mutations à F₁. Moins de poissons fondateur doivent être analysées pour produire la première génération, en raison du taux de mutation plus élevé. Dans l’électroporation, plus de poisson fondateur doivent être analysées qui augmentera les coûts. Cependant, la survie des embryons de barbue micro est inférieure à électroporation ceux, même si cela peut être surmonté en injectant plus embryons^31,32. Barbue de rivière, la survie des embryons de jaune d’oeuf-micro varie de 16 à 55 % selon les gènes ciblés et le dosage de la protéine gRNA/Cas9³².

Microinjection régulière des embryons de poisson-chat est techniquement difficile et chronophage, cependant, un protocole de microinjection de protéine CRISPR/Cas9 rapid et efficace est présenté pour les embryons de barbue. Ce protocole requiert moins de temps et expertise, puisque la solution protéique CRISPR/Cas9 est injectée dans le jaune d’un embryons de cellule. Des centaines d’oeufs fécondés peuvent être injectés en 1 h (environ le temps nécessaire à la première division cellulaire se produire). Pour valider le protocole, deux gènes reliés à la susceptibilité de la maladie ont été éliminés barbue, le gène molécule (TICAM1) adaptateur sans frais/interleukine 1 récepteur contenant du domaine et le gène de lectine (RBL) de liaison de rhamnose. 1 TICAM est impliqué dans la voie de signalisation initiée par récepteur toll-like (TLR) 3. Chez la barbue, TICAM 1 a considérablement augmenté suite à un tacle bactérien avec Edwardsiella ictaluri, alors qu’il était diminuée dans le poisson-chat bleu, une espèce résistante à ictaluri E.³³. RBL joue un rôle important dans l’infection précoce avec celui de Flavobacterium, l’agent causal de la maladie columnaris, où aiguë et upregulation robuste a été enregistrée chez une souche de barbue columnaris-sensible par rapport à un souche résistante à columnaris³⁴.