JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genética

Microinjection كريسبر/Cas9 البروتين في أجنة سمك السلور القناة، Ictalurus punctatus، لتحرير الجينات

Published: January 20, 2018
doi:
10.3791/56275
, , , , , , ,
1School of Fisheries, Aquaculture and Aquatic Sciences,Auburn University, 2Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine,Suez Canal University, 3Anatomy and Embryology Department, Faculty of Veterinary Medicine,Cairo University, 4Department of Molecular Physiology and Biophysics,Vanderbilt University, 5Life Science Institute,University of Michigan

Summary

ويقدم بروتوكول microinjection بسيطة وفعالة لتحرير الجينات في أجنة سمك السلور قناة باستخدام نظام كريسبر/Cas9. في هذا البروتوكول، دليل الكشف وكانت ميكروينجيكتيد Cas9 البروتين في صفار البيض الأجنة خلية واحدة. وقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول بانقطاع قناة سمك السلور اثنين من الجينات المتصلة بجهاز المناعة.

Abstract

تم تسلسل الجينوم الكامل من سمك السلور القناة، Ictalurus punctatus،، مما يؤدي إلى المزيد من الفرص لدراسة وظيفة الجينات سلور قناة. وقد استخدمت الجينات بالضربة القاضية لدراسة هذه وظائف الجينات في فيفو. بانتظام مجمع إينتيرسباسيد في البروتين قصيرة المتناوب يكرر/كريسبر المرتبطة 9 (كريسبر/Cas9) نظام أداة قوية تستخدم لتحرير الجينوم تسلسل الحمض النووي لتغيير وظيفة الجينات. بينما كان النهج التقليدي لإدخال مرناً كريسبر/Cas9 في الأجنة خلية مفردة من خلال microinjection، وهذا يمكن أن يكون عملية بطيئة وغير فعالة في سمك السلور. ويرد هنا، بروتوكول مفصل ل microinjection أجنة سمك السلور قناة مع البروتين كريسبر/Cas9. بإيجاز، كانت البيض والحيوانات المنوية إخصاب المجمعة ومصطنعة ثم يقوم. ونقل البويضات المخصبة إلى طبق بتري يحتوي على الحل هولتفريتير. معايرة حجم الحقن وثم دليل استهداف الكشف/Cas9 تم ميكروينجيكتيد عدد القتلى/انترلوكين 1 مستقبلات المحتوية على المجال محول جزيء (تيكام 1) الجينات وملزمة rhamnose يكتين (ربل) الجينات في صفار البيض الأجنة خلية واحدة. خروج المغلوب الجينات كانت ناجحة حيث تم تأكيد إينديلس بتسلسل الحمض النووي. شملت فراميشيفت التعديلات تسلسل البروتين المتوقعة بسبب هذه الطفرات واقتطاع البروتين بسبب codons توقف سابق لأوانه.

Introduction

Microinjection أسلوب مختبرية شائعة المستخدمة لتسليم كمية صغيرة من مادة مثل الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتين، والجزيئات الكبيرة الأخرى في الخلايا أو الأجنة من خلال زجاج شعرية1. Microinjection تتم باستخدام إعداد المعدات الخاصة بما في ذلك من ميكروينجيكتور، ميكرومانيبولاتور، و مجهر2. وقد استخدمت التقنية باحثون وراثيا تعديل العديد من الكائنات الحية من خلال توليد الوراثي والجينات بالضربة القاضية، والعلاج الجيني، بهدف فهم ديناميات المكونات داخل الخلايا3،4 , 5.

سمك السلور قناة (Ictalurus punctatus) من أنواع سمك السلور الأكثر شعبية في تربية الأحياء المائية وأنشطة الصيد الترفيهي في الولايات المتحدة. هناك حاجة متزايدة لدراسة الجينوم الوظيفي في سمك السلور القناة، وتسلسل الجينوم الكامل لسمك السلور قناة يعزز فائدة التقدم الذي أحرز مؤخرا في أدوات التحرير الجينوم6،7. فهم وظيفة الجينات ليس من شأنه أن يثري البحوث التي تجري على سمك السلور، بل قد يؤدي أيضا إلى زيادة فعالية برامج التحسين الوراثي لتعزيز صناعة سمك السلور. حالما يتم تحديد الجينات الحاسمة لسمة معينة للفائدة، يمكن استخدامها لتحسين وراثيا إنتاج سمك السلور عن طريق تحرير الجينوم لتوليد الآليلات مفيدة، التحديد لهذه الآليلات، قمع الآليلات الضارة، نقل الآليلات مفيدة من خلال ترانسجينيسيس أو بعض تركيبة من هذه الخيارات. الجمع بين الجينات أفضل لمختلف الصفات المفيدة تجارياً من مختلف الأنواع في الأسماك أحد أن يحسن الإنتاجية والربحية ل عمليات إنتاج الأسماك8كثيرا.

خروج المغلوب الجينات أسلوب مباشر لدراسة وظائف الجينات في فيفو. سوف وراثة الطفرات على مستوى الحمض النووي من قبل الأجيال القادمة التي سوف تسهل دراسة آثارها في مختلف الأجيال. الجينوم مختلف أدوات التحرير تم المتقدمة بما في ذلك الزنك الإصبع نوكليسيس (زفنس)، النسخ المستجيب المنشط–مثل نوكليسيس (تالينس)، وتجمع بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب يكرر/كريسبر-المرتبطة البروتين 9 (كريسبر/Cas9 ) نظام9،10،،من1112.

نظام كريسبر/Cas9 هو أداة قوية وفعالة التي تم استخدامها لتحرير الجينوم تسلسل الحمض النووي بما في ذلك خروج المغلوب الجينات في الأسماك إلى الجيش الملكي النيبالي تسترشد خاصة بالموقع الحمض النووي انشقاق5،13. يتألف النظام من دليل رنا (جرنة)، الذي يحدد تسلسل المستهدفة في الجينوم وإنزيم اندونوكليسي الحمض النووي، Cas9. يمكن تصميم نظام كريسبر/Cas9 لاستهداف أي تسلسل في الجينوم مع العديد من المزايا زفنس وتالينس: (1) انخفاض التكاليف الهندسية (2) أسهل ملزمة محددة (3) أكثر من دليل الحمض النووي الريبي لتسلسل المستهدفة، وتخفيض الطفرات خارج الهدف (4) يمكن استهداف سلاسل متعددة مع جرنة مختلفة في نفس الوقت (5) معدل الطفرات عالية في الجينات التي يمكن أن لا تكون المتحولة بواسطة تالينس، وتحسين الخط (6) انتقال معدل الطفرات ليصل إلى 6-fold عند زفنس وتالينس14، بالمقارنة 15،16،،من1718.

هو الأسلوب البديل الرئيسي ل microinjection انهانسر، التي تطبق فيها النبضات الكهربائية للأجنة أو الخلايا لزيادة نفاذية الغشاء وامتصاص الجزيئات البيولوجية19،20. عدة من الأسماك المحورة وراثيا تم إنشاؤها باستخدام انهانسر مثل الميداكا (Oryzias latipes)، الزرد (دانيو rerio)، سلمون شينوك (Oncorhynchus تشاويتشا)، وسمك السلور القناة، الشبوط (Sparus صربا)، و المشتركة الكارب (Cyprinus carpio)21،،من2223،24،،من2526.

وقد استخدمت انهانسر توفير البروتين بلازميد الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، و Cas9 لخروج المغلوب الجينات. في خلايا الثدييات، Cas9/جرنة بلازميد الحمض النووي، مرناً Cas9/جرنة، ومجمعات البروتين/جرنة Cas9 تم تسليمها باستخدام انهانسر وكانت المعدلات الطفرات أعلى باستخدام مجمعات البروتين/جرنة Cas9 لمعظم شروط اختبار انهانسر27. حبليات أسسيديان (سيونا إينتيستيناليس)، كانت تالينس الإعراب عن نيات اليكتروبوراتيد في البيض المخصب للحث على خروج المغلوب من جينات متعددة28. وكانت زفنس الإعراب عن نيات بلازميد اليكتروبوراتيد لضرب الهرمون في سمك السلور القناة29. ومع ذلك، بمجرد إدخال في الخلية، سوف تحتاج ثوابت بلازميد نسخها للجيش الملكي النيبالي وترجم إلى البروتينات الوظيفية قبل أن يمكن توجيهها بتسلسل الحمض النووي المطلوب، والمرجح أن تأخير وقت الطفرات microinjection من الجيش الملكي النيبالي بالمقارنة مع/ البروتين. كما يتم وضع جنين، يزيد الطفرات تأخر mosaicism المؤسسين حقن. وباﻹضافة إلى ذلك، التعبير المعدلة وراثيا غير المحتمل أن يحقق مستوى التعبير الممكنة مع microinjection، خفض كفاءة الطفرات.

كوسيلة لإدخال أدوات التحرير الجينوم في الخلايا، microinjection مزايا عديدة على مدى انهانسر. ويمكن إدخال الجينوم تحرير جزيئات موثوق في الخلايا أو الأجنة من خلال microinjection30. هناك حاجة أقل مواد الحقن. فمن السهل لتحديد كميات المواد التي تحقن. تحقيق طفرة أعلى يمكن أن تكون معدلات مع mosaicism منخفضة في الأسماك مؤسس الذي من شأنه أن يحسن نقل الخط من الطفرات و1. أقل مؤسس الأسماك تحتاج إلى تحليل لإنتاج الجيل الأول، نظراً لارتفاع معدل التحور. في انهانسر، المزيد من الأسماك مؤسس بحاجة إلى تحليل مما يزيد من التكاليف. ومع ذلك، بقاء الأجنة سلور قناة ميكروينجيكتيد أقل من اليكتروبوراتيد منها، على الرغم من أن هذا يمكن التغلب عليها عن طريق حقن الأجنة أكثر31،32. في القناة سمك السلور وبقاء الأجنة ميكروينجيكتيد صفار البيض تراوحت من 16 إلى 55%، اعتماداً على الجينات المستهدفة وجرعة البروتين جرنة/Cas932.

من الناحية الفنية تطالب microinjection العادية أجنة سمك السلور ومضيعة للوقت، ومع ذلك، بروتوكول microinjection بروتين كريسبر/Cas9 سريعة وفعالة ويرد لاجنة سمك السلور قناة. يتطلب هذا البروتوكول أقل من الوقت والخبرة منذ حل البروتين كريسبر/Cas9 يحقن صفار البيض من إحدى خلايا الأجنة. يمكن حقن مئات بويضات المخصبة في ح 1 (تقريبا الوقت اللازم لانقسام الخلية الأولى تحدث). للتحقق من البروتوكول، خرج اثنين من الجينات المتعلقة بقابلية المرض في قناة سمك السلور وعدد القتلى/انترلوكين 1 مستقبلات المجال التي تحتوي على محول جزيء (TICAM1) الجين والجين يكتين (ربل) ملزمة rhamnose. 1 تيكام تشارك في مسار الإشارات بدأها عدد القتلى مثل مستقبلات (TLR) 3. 1 تيكام كان هائلا في سمك السلور القناة، upregulated عقب التحدي البكتيرية مع إيكتالوري ادواردسيلا، بينما كان دوونريجولاتيد في سمك السلور الزرقاء، الأنواع المقاومة إيكتالوري هاء-33. ربل تلعب دوراً هاما في الإصابة المبكرة مع كولومناري فلافوباكتيريوم، المسبّب للمرض كولومناريس، حيث الحادة وسجلت upregulation قوية في سلالة كولومناريس عرضه قناة قرموط بالمقارنة مع 34من سلالة كولومناريس المقاوم.

Protocol

أجريت هذه التجربة في وحدة بحوث الوراثة السمكية، هاء دبليو شل مركز بحوث مصائد الأسماك، وجامعة أوبورن، بن. بموافقة جميع البروتوكولات التجريبية المستخدمة في هذه التجربة برعاية الحيوان المؤسسية جامعة أوبورن واستخدام اللجنة (الاتحاد الأفريقي-IACUC) قبل الشروع التجربة. يمكن الاطلاع على قائمة با…

Representative Results

لإثبات فعالية البروتوكول microinjection، كانت ميكروينجيكتيد جرناس مصممة لاستهداف قناة سمك السلور مستقبلات عدد القتلى/انترلوكين 1 التي تحتوي على المجال محول جزيء (TICAM1) الجينات وملزمة rhamnose يكتين (ربل) الجينات. تيكام 1تسلسل الحمض النوو?…

Discussion

وقدم بروتوكول مفصل ل microinjection أجنة سمك السلور قناة لتحقيق الضربة القاضية الجينات. الحقن بالبروتين كريسبر/Cas9 في صفار البيض هي أبسط بكثير ويوفر الوقت ولا تتطلب تدريبا مكثفا بالمقارنة مع ميكروينجيكتينج بلاستوديسك الجنين خلية واحدة، وهي تقنية شائعة لمعظم نقل الجينات والجينات التحرير مع الأس…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث بجائزة NIFA وزارة الزراعة عام 2015-67015-23488 لمخروط روجر. يشكر المؤلفون الدكتور رونالد فيلبس عن وصف لمعايير اختيار الأسهم الحضنة في شريط الفيديو. الأسود أحمد وكريم خليل يود أن يشكر مكتب التربية والثقافة المصرية في واشنطن العاصمة لتمويل أبحاث الدكتوراه.

Materials

Reproboost implant Center of Marine Biotechnology Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females
TRICAINE-S Western Chemical. Inc. For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping. 
Phenol red Sigma-Aldrich P0290 0.5%, sterile filtered
Stereo microscope Olympus 213709 For visualizing the eggs during microinjection
Microinjector ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MPPI-3 For the delivery of the injection material into the embryos
Micromanipulator ASI-Applied Scientific Instrumentation  Model MM33  For holding and controlling the movement of the injection needle. 
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956.003 For loading injection solution into microinjection needles.
Vertical needle puller David Kopf Instruments Model 720 For pulling microinjection needles
Cas9 protein PNA Bio Inc.  CP01 Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.
Expand High FidelityPLUS PCR System  Roche Diagnostics, USA For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation
Borosilicate glass capillaries Fisher Scientific 1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.
Petri dish VWR 25384-302 For holding the embryos during the microinjection.
Crisco The J.M. Smucker Company Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes. 
Holtfreter`s solution Home Made 59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch. 
Doxycycline hyclate USP (monohydrate) Letco Medical 690904 Antibiotic added to Holtfreter's solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
  2. Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. . Components of a microinjection system. , 935-939 (2011).
  3. Du, S. J., et al. Growth enhancement in transgenic Atlantic salmon by the use of an "all fish" chimeric growth hormone gene construct. Nat. Biotechnol. 10 (2), 176-181 (1992).
  4. Davis, B., Brown, D., Prokopishyn, N., Yannariello-Brown, J. Micro-injection-mediated hematopoietic stem cell gene therapy. Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (4), 412-419 (2000).
  5. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  6. Liu, Z., et al. The channel catfish genome sequence provides insights into the evolution of scale formation in teleosts. Nat. Commun. 7, (2016).
  7. Abdelrahman, H., et al. Aquaculture genomics, genetics and breeding in the United States: current status, challenges, and priorities for future research. BMC Genomics. 18 (1), 191 (2017).
  8. Dunham, R. A. . Aquaculture and Fisheries Biotechnology : Genetic Approaches. , (2011).
  9. Miller, J. C., et al. An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat. Biotechnol. 25 (7), 778-785 (2007).
  10. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  11. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  12. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  13. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Cradick, T. J., Fine, E. J., Antico, C. J., Bao, G. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 41 (20), 9584-9592 (2013).
  16. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  17. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  18. Li, M., Zhao, L., Page-McCaw, P. S., Chen, W. Zebrafish genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Trends Genet. 32 (12), 815-827 (2016).
  19. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841 (1982).
  20. Powers, D. A., et al. Electroporation: a method for transferring genes into the gametes of zebrafish (Brachydanio rerio), channel catfish (Ictalurus punctatus), and common carp (Cyprinus carpio). Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 301-308 (1991).
  21. Inoue, K., et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Differ. Dev. 29 (2), 123-128 (1990).
  22. Buono, R., Linser, P. Transient expression of RSVCAT in transgenic zebrafish made by electroporation. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1 (4-5), 271-275 (1991).
  23. Sin, F., et al. Gene transfer in chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA. Aquaculture. 117 (1-2), 57-69 (1993).
  24. Dunham, R. A., et al. Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel catfish Ictalurus punctatus possessing cecropin genes. Mar. Biotechnol. 4 (3), 338-344 (2002).
  25. Lu, J. K., Fu, B. H., Wu, J. L., Chen, T. T. Production of transgenic silver sea bream (Sparus sarba) by different gene transfer methods. Mar. Biotechnol. 4 (3), 328-337 (2002).
  26. Cheng, Q., et al. Interaction of diet and the masou salmon Δ5-desaturase transgene on Δ6-desaturase and stearoyl-CoA desaturase gene expression and N-3 fatty acid level in common carp (Cyprinus carpio). Transgenic Res. 23 (5), 729-742 (2014).
  27. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J. Biotechnol. 208, 44-53 (2015).
  28. Treen, N., et al. Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts by TALEN electroporation provide new approaches to investigating gene function in Ciona. Development. 141 (2), 481-487 (2014).
  29. Qin, Z., et al. Editing of the luteinizing hormone gene to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using a modified zinc finger nuclease technology with electroporation. Mar. Biotechnol. 18 (2), 255-263 (2016).
  30. Qin, Z. . Gene editing of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone and gonadotropin-releasing hormone genes to sterilize channel catfish, Ictalurus punctatus, using zinc finger nuclease, transcription activator-like effector nuclease and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 technologies. , (2015).
  31. Dunham, R. A., Winn, R. N., Pinkert, C. A. . Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook. , 308-336 (2014).
  32. Elaswad, A. . Genetic technologies for disease resistance research and enhancement in catfish. , (2016).
  33. Baoprasertkul, P., Peatman, E., Somridhivej, B., Liu, Z. Toll-like receptor 3 and TICAM genes in catfish: species-specific expression profiles following infection with Edwardsiella ictaluri. Immunogenetics. 58 (10), 817-830 (2006).
  34. Thongda, W., Li, C., Luo, Y., Beck, B. H., Peatman, E. L-rhamnose-binding lectins (RBLs) in channel catfish, Ictalurus punctatus: Characterization and expression profiling in mucosal tissues. Dev. Comp. Immunol. 44 (2), 320-331 (2014).
  35. Phelps, R. P., et al. Effects of temperature on the induced spawning of channel catfish and the production of channel× blue catfish hybrid fry. Aquaculture. 273 (1), 80-86 (2007).
  36. Poole, W., Dillane, M. Estimation of sperm concentration of wild and reconditioned brown trout, Salmo trutta L. Aquacult. Res. 29 (6), 439-445 (1998).
  37. Billard, R. Spermatogenesis and spermatology of some teleost fish species. Reprod. Nutr. Dev. 26 (4), 877-920 (1986).
  38. Coyle, S. D., Durborow, R. M., Tidwell, J. H. . Anesthetics in aquaculture. , (2004).
  39. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nat. Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  40. Armstrong, J., Duhon, S., Malacinski, G. . Developmental Biology of the Axolotl. , 220-227 (1989).
  41. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J. Vis. Exp. (46), (2010).
  42. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055 (2016).
  43. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  44. Silverstein, J. T., Small, B. C., Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. . Biology and Culture of Channel Catfish. 34, 69-94 (2004).
  45. Su, B., et al. Relative effectiveness of carp pituitary extract, luteininzing hormone releasing hormone analog (LHRHa) injections and LHRHa implants for producing hybrid catfish fry. Aquaculture. 372, 133-136 (2013).
  46. Aluru, N., et al. Targeted mutagenesis of aryl hydrocarbon receptor 2a and 2b genes in Atlantic killifish (Fundulus heteroclitus). Aquat. Toxicol. 158, 192-201 (2015).
  47. Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
  48. Edvardsen, R. B., Leininger, S., Kleppe, L., Skaftnesmo, K. O., Wargelius, A. Targeted mutagenesis in Atlantic salmon (Salmo salar L.) using the CRISPR/Cas9 system induces complete knockout individuals in the F0 generation. PLoS ONE. 9 (9), e108622 (2014).
  49. Li, M., et al. Efficient and heritable gene targeting in tilapia by CRISPR/Cas9. Genética. 197 (2), 591-599 (2014).
  50. Zhong, Z., et al. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp. Sci. Rep. 6, (2016).
  51. Chakrapani, V., et al. Establishing targeted carp TLR22 gene disruption via homologous recombination using CRISPR/Cas9. Dev. Comp. Immunol. 61, 242-247 (2016).
  52. Lim, J., Ghadessy, F. J., Yong, E. A novel splice site mutation in the androgen receptor gene results in exon skipping and a non-functional truncated protein. Mol. Cell. Endocrinol. 131 (2), 205-210 (1997).
  53. Gatfield, D., Unterholzner, L., Ciccarelli, F. D., Bork, P., Izaurralde, E. Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian pathways. The EMBO Journal. 22 (15), 3960-3970 (2003).
  54. Talerico, M., Berget, S. M. Effect of 5’splice site mutations on splicing of the preceding intron. Mol. Cell. Biol. 10 (12), 6299-6305 (1990).

Tags

Keywords: CRISPR/Cas9MicroinjectionChannel CatfishIctalurus PunctatusGene EditingTICAM1RBLBroodstock SelectionSpawningLHRHAHormone InjectionEmbryoProtocolFunctional Genomics
check_url/pt/56275?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Elaswad, A., Khalil, K., Cline, D., Page-McCaw, P., Chen, W., Michel, M., Cone, R., Dunham, R. Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing. J. Vis. Exp. (131), e56275, doi:10.3791/56275 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image