Summary

Proteomic 분석에 대 한 인간의 망막과 맥락 막의 RPE의 해 부

Published: November 12, 2017
doi:

Summary

인간의 망막 fovea, 흑점, 그리고 주변 망막을 포함 하 여 기능 및 분자로 별개 영역 구성 됩니다. 여기, 펀치 생 검 및 인간의 눈에서 조직 층의 수동 제거를 사용 하 여 부하 다운스트림 proteomic 분석이 고유한 망막 영역을 수집 하는 방법을 설명 합니다.

Abstract

인간의 망막 혈관 맥락 막 층을 단단히 complexed은 감각 neuroretina 및 근본적인 망막 안료 상피 (RPE)의 구성 됩니다. 망막의 다른 영역은 해부학 및 분자로 독특한, 독특한 기능을 촉진 하 고 질병에 차동 민감성을 보여주는입니다. 각 이러한 영역 및 레이어 Proteomic 분석 연령 황 반 변성 (AMD), 녹 내장, 당뇨병, 등 많은 질병의 분자 과정에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그러나, 망막 지역과 계층의 분리 정량 proteomic 분석을 수행할 수 있습니다 전에 필수적 이다. 여기, 해 부 및 컬렉션의 시야, 황 반, 및 주변 망막 영역 및 근본적인 RPE 맥락 막 복잡 한, 지역 펀치 생 검 및 인간의 눈에서 조직 층의 수동 제거를 포함 하는 방법을 설명 합니다. 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 등 다운스트림 proteomic 분석 뿐만 아니라 1 차원 SDS 페이지 사용할 수 있습니다 각 해 부 망막 층에 단백질을 식별 하기 위해 망막 질환에 대 한 분자 biomarkers를 공개.

Introduction

망막, RPE, 및 맥락 막 단백질 표정, 생리 적 기능 및 병 적인 감정1,2에서 중요 한 지역 차이 보여 주는 복잡 한 조직이 있습니다. 예를 들어 등 의학 황 반 변성 (AMD), 망막 화, 중심 장 액 망막 질환 각 질병 특성 지역화 fovea, 흑점, 또는 망막 주변1,3, 설명 4,6. 여기, 우리가 어떻게 다른 망막 영역 수 수 독립적으로 샘플링 하지를 보여주는 방법 제시. 이 방법의 전반적인 목표 proteomic 분석에 대 한 인간의 망막 및 RPE 맥락 막 시야, 황 반, 및 주변 지역에서 조직 샘플의 컬렉션에 대 한 신뢰할 수 있는 가이드를 제공 하는 것입니다. 개발 및이 기술의 사용에 대 한 근거는 이러한 특정 망막 지역, 중요 한 분자 통찰력이이 지역의 생리 및 병 태 생리 기능에 기록 될 수 있습니다의 proteomic 분석을 통해.

이 접근에는 상대 지역 질병 감정, proteomic 기초를 공개 하 고 새로운 구체적인 치료 목표의 식별을 용이 하 게 약속 드립니다. 실제로, 유리 체 및 망막에와 함께 자사의 상호 작용의 proteomic 조사 분자 조성과 건강 하 고 병에 걸리는 조직5,,78 의 기능에 중요 한 통찰력 제공 , 9 , 10 , 11 , 12 , 그러나 13. 별개의 망막 영역의 명확한 비교 proteomic 분석 결여 되는. 기술은 안정적이 고 재현 가능한 조직 컬렉션 접근으로 다른 방법 이상의 장점을 제공이 많이 필요한 연구를 지원 하기 위해 도움이 됩니다. 더 많은 그래서, 방식은 매우 접근 하 고, 표준 사이즈와 쉽게 사용할 수 있는 조직 펀치 생 검 도구 활용 합니다. 우리의 기술 강조 적절 한 수집 및 proteomic 처리, 단백질 안정성과 성능 저하에 대 한 중요 한 고려 사항에 대 한 조직의 저장 합니다. 따라서,이 방법은 proteomic 요인의 다운스트림 분자 분석을 고려 하 고 조사에 가장 적합 합니다.

Protocol

이 연구는 아이오와의 대학에 의해 승인 되었다 ' s 기관 검토 위원회와 헬싱키의 선언에 명시 된 신조에 고착. 1. Foveal 및 황 반 생 검 펀치 오픈 및 나비 인간의 눈, 그것은 조직의 4 별도 플랩의 이전 게시에 설명 된 대로 구성 되어 그런 . 5 butterflied 육안 페 트리 접시에 배치와 함께 시작, 4 m m 펀치 생 검 도구는 fovea에 센터, 누르고는 fovea ?…

Representative Results

망막 및 맥락 막의 RPE 조직 개별 조사에 맞게 다양 한 방법으로 처리할 수 있습니다. 수령 후, 연구원 망막 및 RPE 맥락 막 시야 지역, 외부 망막 및 주변 망막 (그림 1)에서 조직 샘플을가지고 것입니다. 특히, 시야 지역 펀치는 fovea, parafovea, 및 인접 한 perifovea의 작은 금액을 포함 됩니다. 황 반 펀치 perifoveal 지역 뿐만 아니라 인접 한 근처 주변 지역의 ?…

Discussion

조직 후 컬렉션, 샘플 처리 및 치료입니다 중요 한 고려 사항14. 액체 질소에 보존은 선호 화학 기정에 후자 손상 될 수 있습니다 다운스트림 분석을 기울일 수 있는 단백질 구조. 또한, 액체 질소 보존 샘플의 포함 하지 않는 방법을 선호입니다. 특히, 페 러 외. 4 ° C 또는 0 ° C15에 저장에 비해 상 온에서 보존 하는 뇌 샘플 사이 단백질 수준에서 큰 차이가 …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VBM은 NIH 교부 금 [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698, R21AG050437], 도리스 듀크 자선 재단 보조금 지원 #: 2013103, 및 연구를 방지 실명 (RPB), 뉴욕, 뉴욕. MT 및 GV는 NIH에서 지원 T32GM007337를 부여.

Materials

4-mm skin punch biopsy tool Miltex REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool Miltex REF 33-37
0.12 Colibri Forceps Stephens Instruments S5-1145
Wescott Scissors Sklar Surgical Instruments 64-3146
Microfuge tubes Eppendorf #022364111 1.5 mL
Liquid Nitrogen Praxair, Inc. 7727-37-9 [R]

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Citar este artigo
Cabral, T., Toral, M. A., Velez, G., DiCarlo, J. E., Gore, A. M., Mahajan, M., Tsang, S. H., Bassuk, A. G., Mahajan, V. B. Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (129), e56203, doi:10.3791/56203 (2017).

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